本文關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯免疫檢測方法的建立及在大鼠模型中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)是酞酸酯類化合物(Phthalate Esters, PAEs)的一種,在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)和加工中應(yīng)用面相當(dāng)?shù)膹V。其用途主要有增塑劑、膠黏劑、潤滑劑等。DBP是通過非共價鍵的方式與其他化合物進(jìn)行連接的,穩(wěn)定性不高,會在加工和使用的過程中,慢慢釋放到環(huán)境中,對人和環(huán)境具有潛在的危害。DBP主要是通過吸入、皮膚接觸、食入等多種途徑進(jìn)入人體,有時候醫(yī)學(xué)注射可以成為一種高危險度的暴露方式。攝入的DBP借助攝入與排泄動態(tài)平衡的方式在人體內(nèi)長時間的累積。研究表明,DBP是一種內(nèi)分泌干擾物,具有生殖毒性、發(fā)育毒性以及致癌等危害。現(xiàn)今,針對DBP的檢測技術(shù)有許多種,但主流的方法還是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chromatography coupled mass spectrometry, GC-MS) 和高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)。但是,這兩種方法操作難度大,檢測費(fèi)用高,對設(shè)備的要求也高,檢測過程耗時,不能實現(xiàn)大量樣品的同時檢測。因此,建立更好的DBP檢測技術(shù),用以了解人體攝入的DBP在機(jī)體內(nèi)的分布和累積情況是人類迫切需要解決的問題。本研究主要分為三個部分。第一部分研究是建立檢測DBP的酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。本研究成功制備出能穩(wěn)定分泌DBP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,并對其進(jìn)行克隆化擴(kuò)大培養(yǎng),成功篩選出高效價和高親和力的DBP單抗,建立了間接競爭ELISA的DBP檢測技術(shù)。此技術(shù)操作方便,成本費(fèi)用較低,同時本研究還對ELISA檢測中的幾種重要反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選,并在最優(yōu)條件下建立了間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=15.401Ln(X)-24.13,R2=0.9973。DBP濃度和抑制率之間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。第二部分研究是將所開發(fā)的DBP單克隆抗體ELISA檢測方法用于生物樣品的檢測。本實驗采用口腔灌胃和皮膚涂抹兩種染毒方式,對大鼠進(jìn)行DBP暴露,兩種方式的DBP暴露濃度均為200mg/kg/D。連續(xù)暴露一周后,在24h、48h、72h時間間隔后,分別處死各組大鼠,利用ELISA檢測技術(shù),檢測DBP在大鼠體內(nèi)肝臟、腎臟、血液、尿液的含量。結(jié)果表明,經(jīng)口腔灌胃染毒處理的大鼠體內(nèi)DBP含量高于皮膚涂抹組,兩種暴露方式之間,實驗組與空白對照組之間皆存在極顯著差別(p0.01)。隨著暴露后間隔時間的延長,大鼠體內(nèi)各器官組中的DBP含量逐漸減少,在72h時間間隔后,DBP殘留量只有微量,說明大鼠體內(nèi)的DBP會隨時問逐漸被代謝掉,并通過尿液排出體外。第三部分研究在ELISA檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上,建立了免疫熒光檢測技術(shù)。本研究采用皮膚涂抹的方式對大鼠進(jìn)行暴露染毒,染毒濃度為200mg/kg,空白組用玉米油進(jìn)行暴露染毒。對大鼠進(jìn)行一周的DBP連續(xù)暴露,在暴露后的24h、48h、72h時間節(jié)點(diǎn),處死各組大鼠,取大鼠肝臟、腎臟、胃、睪丸等器官,制作冰凍切片,然后利用免疫熒光技術(shù),結(jié)合DBP單抗的制備,檢測DBP在各器官的分布和累計情況。免疫熒光技術(shù)采用雙標(biāo)記,可以從視覺上展示DBP在機(jī)體內(nèi)的分布和累積情況,結(jié)果顯示DBP在皮下組織如汗腺和毛囊中出現(xiàn)累積情況,在肝和腎中的累積量較大,還發(fā)現(xiàn)DBP可以穿透大鼠的生物屏障進(jìn)入睪丸中。在通過對大鼠暴露后的24h、48h、72h體內(nèi)DBP的殘留量檢測,發(fā)現(xiàn)通過皮膚涂抹暴露后,大鼠體內(nèi)的DBP會在2-3內(nèi)迅速代謝并排出。
【關(guān)鍵詞】：鄰苯二甲酸二丁酯(DBP) 單克隆抗體 生物累積 器官組織分布 免疫熒光技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R-332;R446.6
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 綜述14-36
• 1.1 研究背景14
• 1.2 研究對象14-15
• 1.3 酞酸酯類化合物的介紹15-19
• 1.4 鄰苯二甲酸二丁酯的理化特性和作用19
• 1.5 DBP的多種暴露方式19-22
• 1.6 DBP的危害22-25
• 1.7 DBP在人體內(nèi)的代謝25-26
• 1.8 常見的檢測PAES的方法26-30
• 1.8.1 免疫分析法26-27
• 1.8.2 色譜法27-30
• 1.9 有機(jī)小分子酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)30-34
• 1.9.1 人工抗原的制備31-32
• 1.9.2 抗體的制備32-34
• 1.10 選題的目的和意義34-36
• 第二章 DBP-MAB的制備及ELISA檢測技術(shù)的建立36-64
• 2.1 實驗材料36-37
• 2.1.1 實驗細(xì)胞36
• 2.1.2 實驗試劑36
• 2.1.3 實驗溶劑36-37
• 2.1.4 實驗儀器37
• 2.2 實驗方法37-49
• 2.2.1 半抗原的合成和結(jié)構(gòu)鑒定37-38
• 2.2.2 人工抗原的合成及結(jié)構(gòu)鑒定38-39
• 2.2.3 小鼠免疫方案39-40
• 2.2.4 抗血清效價的測定40-41
• 2.2.5 抗血清靈敏度的檢測41-42
• 2.2.6 MAB的制備與純化42-45
• 2.2.7 單抗的純化45-47
• 2.2.8 人工抗原包被的ELISA檢測方法的優(yōu)化與建立47-49
• 2.2.9 單抗特異性檢測49
• 2.3 數(shù)據(jù)分析49
• 2.4. 實驗結(jié)果49-61
• 2.4.1 半抗原結(jié)構(gòu)的鑒定49
• 2.4.2 人工抗原結(jié)構(gòu)的鑒定49-51
• 2.4.3 抗血清效價51
• 2.4.4 抗血清靈敏度51-52
• 2.4.5 雜交瘤細(xì)胞株的建立52-53
• 2.4.6 單克隆抗體的純化53-54
• 2.4.7 icELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化54-58
• 2.4.8 人工抗原包被的間接競爭ELISA檢測方法的建立58-60
• 2.4.9 單抗特異性的檢測60-61
• 2.5 討論61-64
• 2.5.1 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇61
• 2.5.2 雜交瘤細(xì)胞的克隆化擴(kuò)大篩選61-62
• 2.5.3 icELISA操作的重要細(xì)節(jié)62
• 2.5.4 ELISA顯示反應(yīng)62-64
• 第三章 間接競爭ELISA法檢測大鼠體內(nèi)的DBP64-77
• 3.1 實驗材料64-65
• 3.1.1 實驗動物64
• 3.1.2 實驗溶劑64-65
• 3.1.3 實驗儀器65
• 3.2 實驗方法65-68
• 3.2.1 環(huán)境樣品中DBP殘留檢測原理65
• 3.2.2 DBP染毒液的配制65
• 3.2.3 DBP暴露方式65-66
• 3.2.4 實驗步驟66-68
• 3.2.5 MBP對DBP抑制率68
• 3.3 數(shù)據(jù)分析68-69
• 3.4 實驗結(jié)果69-74
• 3.4.1 DBP標(biāo)準(zhǔn)曲線69-70
• 3.4.2 肝中DBP含量的檢測70-71
• 3.4.3 腎中DBP含量的檢測71-72
• 3.4.4 血液中DBP含量的檢測72-73
• 3.4.5 尿液中DBP含量的檢測73-74
• 3.4.6 MBP對DBP抑制率74
• 3.5. 討論74-77
• 3.5.1 酶聯(lián)免疫技術(shù)的改進(jìn)-BA-ELISA74-75
• 3.5.2 兩種暴露方式的比較75-77
• 第四章 免疫熒光法測大鼠體內(nèi)的DBP77-91
• 4.1 實驗材料77-78
• 4.1.1 實驗動物77
• 4.1.2 實驗儀器77
• 4.1.3 實驗試劑77
• 4.1.4 實驗溶劑77-78
• 4.2 實驗方法78-80
• 4.2.1 DBP染毒液的配制78
• 4.2.2 DBP的暴露方法78
• 4.2.3 實驗機(jī)理圖78-79
• 4.2.4 實驗步驟79-80
• 4.3 數(shù)據(jù)分析80-81
• 4.4 實驗結(jié)果81-88
• 4.4.1 肝臟免疫熒光結(jié)果81-82
• 4.4.2 腎臟免疫熒光結(jié)果82-83
• 4.4.3 胃免疫熒光結(jié)果83-84
• 4.4.4 睪丸免疫熒光結(jié)果84-85
• 4.4.5 各器官的比較85-86
• 4.4.6 肝臟經(jīng)24h、48h、72h處理后的熒光強(qiáng)度比較86-87
• 4.4.7 腎經(jīng)24h、48h、72h處理后的熒光強(qiáng)度比較87-88
• 4.5 討論88-91
• 4.5.1 DBP經(jīng)大鼠皮膚暴露的可行性分析88-89
• 4.5.2 關(guān)于DBP含量的計算89
• 4.5.3 免疫熒光技術(shù)的意義89-90
• 4.5.4 皮膚涂抹的方式90-91
• 第五章 結(jié)論91-93
• 參考文獻(xiàn)93-105
• 附錄1 主要英文縮寫詞105-106
• 附錄2 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文106-111
• 致謝111-112

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯免疫檢測方法的建立及在大鼠模型中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：400193