本文關(guān)鍵詞：NEK2與前列腺癌侵襲性和預(yù)后的相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的：中心體是人類細(xì)胞的微管組織中心,在有絲分裂紡錘體的形成和染色體分離起到關(guān)鍵作用。有研究顯示各種各樣組織來源的癌細(xì)胞通常表現(xiàn)出與中心體數(shù)目或結(jié)構(gòu)相關(guān)的多極紡錘體。而一些位于中心體的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶,是有絲分裂進(jìn)程和形成正確雙極紡錘體所必需的。目前公認(rèn)的中心體相關(guān)激酶是NEK2,它有兩種剪接變體NEK2A和NEK2B。它們的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期。NEK2是活性的絲氨酸和蘇氨酸激酶,磷酸化多種參與中心體復(fù)制和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白質(zhì)。其結(jié)合微管,在中心體含量豐富,有助于中心體在細(xì)胞周期的G2/M期分裂。異常NEK2活動因未能調(diào)節(jié)中心體復(fù)制,從而導(dǎo)致非整倍體,這些都是腫瘤發(fā)生的影響因素。目前已經(jīng)證實(shí)包括乳腺癌、肺癌、睪丸癌和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤等人類腫瘤中NEK2表達(dá)水平增高。NEK2在非轉(zhuǎn)化的乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)會導(dǎo)致中心體過度復(fù)制。內(nèi)源性NEK2表達(dá)增加導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的中心體擴(kuò)增并表達(dá)致癌的K-ras。從目前的研究來看,NEK2在癌細(xì)胞中經(jīng)常存在表達(dá)的明顯升高。雖然在腫瘤細(xì)胞中觀察到了NEK2的增量調(diào)節(jié)和基因不穩(wěn)定性,但是NEK2的上調(diào)在前列腺癌作用仍不明確。在這項(xiàng)研究中,我們調(diào)查了人類前列腺癌組織芯片的NEK2表達(dá)模式和抑制NEK2的表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞增殖功能的改變。結(jié)果顯示NEK2的表達(dá)與前列腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。總之,NEK2過度表達(dá)可以預(yù)測前列腺癌復(fù)發(fā)。材料和方法：患者及組織：該研究得到廣州醫(yī)科大學(xué)廣州市第一人民醫(yī)院的倫理委員會批準(zhǔn)。所有的患者都簽署知情同意。所有標(biāo)本均按照道德和法律標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行匿名處理。免疫組化分析使用組織芯片購自上海(Shanghai Outdo Biotech Co, LTD (Cat No:HPro-Ade180PG-01),該芯片包含99例前列腺原位癌組織及81例前列腺癌旁組織,附帶患者相應(yīng)的臨床信息,且所有患者術(shù)前均沒有接受過化療及放療。Taylor數(shù)據(jù)庫包含149例接受前列腺癌根治術(shù)病人的前列腺癌組織和29例癌旁良性組織的mRNAs表達(dá)水平,對應(yīng)患者總體生存時(shí)間和術(shù)后1至175個(gè)月(平均51個(gè)月)的后續(xù)檢查等詳細(xì)臨床資料。前列腺癌根治術(shù)的日期被視為生存分析的第一天。PSA復(fù)發(fā)被認(rèn)為是無生化復(fù)發(fā)終點(diǎn)。除了意外原因,死亡被認(rèn)為是總生存期的終點(diǎn)。細(xì)胞培養(yǎng),轉(zhuǎn)染和處理細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是把2×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板,培養(yǎng)24小時(shí),48小時(shí)和72小時(shí)后每孔加CCK8溶液(Cat No:C0038, Beyotime, China) 20ul,37℃繼續(xù)孵育4小時(shí),終止培養(yǎng)。每孔選擇495nm波長,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。RNA的干擾,按照說明書的方法用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,然后培養(yǎng)培養(yǎng)24小時(shí),48小時(shí)和72小時(shí)再行檢測分析。QRT-PCR使用TRIzol法從前列腺癌細(xì)胞和組織中提取RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄。所有數(shù)據(jù)用Opticon Monitor software(ver3.1, Bio-Rad)分析。Western blotting轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取蛋白。取40μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS—PAGE凝膠電泳后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至膜上.標(biāo)記預(yù)染的位置。5%脫脂牛奶封閉,并加入NEK2抗體(bs-5732R, Bioss Co Ltd.,China)和β-actin抗體(sc-47778,Santa Cruz, USA)。腫瘤種植平均6-8周的裸鼠在廣州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。0.1ml培養(yǎng)液里2×10 6個(gè)細(xì)胞與等量的Matrigel(貨號：356234, BD Biosciences)充分混合,滅菌。轉(zhuǎn)染了NEK2 siRNA的LNCaP細(xì)胞株注射在裸鼠的左側(cè),對照的細(xì)胞注射在裸鼠的右側(cè)。我們使用卡尺測量腫瘤,并在三個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)計(jì)算出的腫瘤的大小,然后在植入細(xì)胞43天后收集腫瘤組織進(jìn)行檢測。免疫組化標(biāo)本在10%福爾馬林固定,隨后包埋在石蠟中。石蠟包埋的組織切成4微米的厚度,然后脫蠟行HE染色或免疫組織化學(xué)染色。簡要地說,切片加入1：400NEK2抗體(bs-5732R,Bioss Co Ltd., China) 4℃培養(yǎng)過夜。隨后洗滌,用過氧化物標(biāo)記的多聚物及色原體基質(zhì)處理以發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的染色情況,在整個(gè)免疫組化實(shí)驗(yàn)中,空白對照不加一抗處理。在蘇木素復(fù)染后,兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理實(shí)驗(yàn)工作者各自獨(dú)立對組織的免疫染色進(jìn)行評分,且這兩位工作者對患者的臨床病理報(bào)告及預(yù)后完全不知情。隨后對兩組評分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行比較,任何有差異評分的切片都要進(jìn)行重新評估,當(dāng)兩位工作人員的評分一致時(shí),癌細(xì)胞的免疫標(biāo)記評估才完成。取十個(gè)典型的顯微鏡下視野并數(shù)出陽性染色細(xì)胞數(shù),計(jì)算出陽性細(xì)胞比例。根據(jù)染色細(xì)胞的比例采取半定量的方式分成4組：0(0%),1(1-10%),2(11-50%),and 3(50%).染色強(qiáng)度進(jìn)行視覺計(jì)評分：0(陰性),1(弱),2(中度)和3(強(qiáng))。最后染色細(xì)胞比例評分及染色深度評分相乘構(gòu)成了最終的免疫組化評分(IRS)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)分析采用SPSSS13.0軟件(Version 13.0 for Windows, SPSS Inc.,IL,USA)和SAS9.1軟件(SAS Institute,Cary, NC, USA)。連續(xù)性變量資料采用X±s表示,One-way ANOVA檢驗(yàn)分析各細(xì)胞株中NEK2的表達(dá)情況,如有差異再用LSD等方法做兩兩比較；兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析NEK2 mRNA在LNCaP scrumble細(xì)胞和siNEK2 LNCaP細(xì)胞的表達(dá)情況；Two-way ANOVA檢驗(yàn)分析細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)和裸鼠不同時(shí)間點(diǎn)皮下移植瘤的體積；Pearson卡方檢驗(yàn)分析它們在前列腺癌與前列腺增生組織中的免疫組化染色情況,兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析它們在前列腺癌組織中的免疫組化評分與前列腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,Kaplan-Meier法估計(jì)總體生存率、無轉(zhuǎn)移生存率、無生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率,并采用log-rank對兩組進(jìn)行比較。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果NEK2在各種前列腺細(xì)胞株中的基因表達(dá)情況運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法在mRNA水平評估3種人類前列腺癌細(xì)胞株(PC3、LNCaP和DU145)和1種人類正常前列腺上皮細(xì)胞株(PrEC)NEK2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對PrEC, NEK2在PC3、LNCaP和DU145三種前列腺癌細(xì)胞株中均有表達(dá)量增加(P0.01)。NEK2促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖為了確定高表達(dá)NEK2是否促成細(xì)胞增殖,利用siRNA技術(shù)構(gòu)建NEK2表達(dá)下調(diào)的LNCaP細(xì)胞。實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot分析表明NEK2在LNCaP細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)和蛋白水平明顯下降。隨后細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,抑制了NEK2基因的LNCaP細(xì)胞生長速度顯著慢于對照組。這結(jié)果表明,NEK2過表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖。敲除NEK2基因的表達(dá)抑制了前列腺癌LNCaP細(xì)胞的侵襲性為了明確抑制NEK2表達(dá)對前列腺癌LNCaP細(xì)胞的侵襲性的影響,我們把轉(zhuǎn)染了siRNA的LNCaP細(xì)胞和對照細(xì)胞種植到同一個(gè)裸鼠的兩側(cè)。在種植后的14、23、36天測量腫瘤的大小,siNEK2細(xì)胞種植側(cè)形成的腫瘤體積明顯縮小。在植入細(xì)胞43天后收集腫瘤組織進(jìn)行檢測。與對照組的腫瘤比較,沉默NEK2的腫瘤不但比較小,顏色還比較淡,這表明腫瘤血管生成也被受到影響。免疫組化染色結(jié)果顯示,在siNEK2轉(zhuǎn)染的LNCaP細(xì)胞移植腫瘤中,NEK2表達(dá)明顯下調(diào)。而在400倍放大背景下,可以清楚看到NEK2蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核和細(xì)胞間質(zhì)中。NEK2在前列腺癌的臨床病理特征為進(jìn)一步明確NEK2在前列腺癌組織中的表達(dá)模式及定位,對購買于上海芯超生物有限公司的含有99例前列腺癌及81例癌旁前列腺組織的組織芯片進(jìn)行免疫組化染色檢測。在癌旁前列腺組織中NEK2免疫組化染色較弱或沒有。NEK2在前列腺癌細(xì)胞中染色強(qiáng),且主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。與前列腺癌Gleason評分8的組織相比較,Gleason評分-8的組織NEK2的表達(dá)量明顯增高。另外,前列腺癌臨床病理分期高的組織,NEK2表達(dá)增加。分析Tylor數(shù)據(jù)與我們組織芯片的結(jié)論相符。運(yùn)用Kaplan meier方法分析NEK2表達(dá)水平跟前列腺癌接受外科根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)生存率、總體生存率的相關(guān)性。以NEK2表達(dá)量的中位數(shù)為分割點(diǎn)將前列腺癌組織分為高表達(dá)組(80例)和低表達(dá)組(80例)。在生化復(fù)發(fā)時(shí)間上,高表達(dá)組明顯比低表達(dá)組更早地出現(xiàn)了生化復(fù)發(fā),但NEK2高表達(dá)組和低表達(dá)組在前列腺癌總體生存率上沒有明顯區(qū)別。結(jié)論：我們的研究首次證明了NEK2的過度表達(dá)與前列腺癌的進(jìn)展相關(guān),這也表明,NEK2能夠作為判斷前列腺癌預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。
【關(guān)鍵詞】：NEK2 前列腺癌 生物學(xué)標(biāo)志物 siRNA
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 前言17-52
• 1.1 前列腺的概述17-23
• 1.2 前列腺癌的現(xiàn)狀23-26
• 1.3 前列腺癌的發(fā)病機(jī)制26-31
• 1.3.1 腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)26-27
• 1.3.2 前列腺癌發(fā)生、發(fā)展27-31
• 1.4 前列腺癌診斷31-34
• 1.4.1 前列腺癌早期診斷31-33
• 1.4.2 前列腺癌晚期診斷33-34
• 1.5 前列腺癌GLEASON評分標(biāo)準(zhǔn)34-39
• 1.6 前列腺癌分期39-43
• 1.6.1 臨床分期39-42
• 1.6.2 病理分期42-43
• 1.7 前列腺癌治療43-47
• 1.7.1 保守治療43
• 1.7.2 根治性前列腺切除術(shù)43-44
• 1.7.3 放射療法44
• 1.7.4 其它療法44-45
• 1.7.5 前列腺癌術(shù)后生化復(fù)發(fā)與治療45-46
• 1.7.6 前列腺癌術(shù)治療的難點(diǎn)46-47
• 1.8 NEK2的功能及研究進(jìn)展47-51
• 1.8.1 NEK2的發(fā)現(xiàn)、基本結(jié)構(gòu)和定位47-48
• 1.8.2 NEK2在細(xì)胞分裂中的功能48-49
• 1.8.3 NEK2與腫瘤49-51
• 1.9 本研究擬解決的問題51-52
• 第二章 材料與方法52-69
• 2.1 材料52-55
• 2.1.1 組織來源及臨床資料52
• 2.1.2 動物52
• 2.1.3 細(xì)胞株52-55
• 2.2 方法55-69
• 2.2.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)55-61
• 2.2.2 Short interfering RNA(siRNA)篩選轉(zhuǎn)染方案61-62
• 2.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8 assay)62-63
• 2.2.4 Western Blot63-65
• 2.2.5 建立裸鼠移植瘤模型65
• 2.2.6 免疫組化染色65-68
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理68-69
• 第3章 結(jié)果69-83
• 3.1 NEK2在各種前列腺細(xì)胞株中的基因表達(dá)情況69-70
• 3.2 NEK2促進(jìn)前列腺癌的增殖70-73
• 3.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明NEK2促進(jìn)腫瘤生長73-77
• 3.4 NEK2在前列腺癌的臨床病理特征77-80
• 3.5 NEK2的低水平表法與前列腺痛預(yù)后差有關(guān)80-83
• 第四章 討論83-88
• 結(jié)論88-89
• 參考文獻(xiàn)89-100
• 第五章 綜述100-121
• 參考文獻(xiàn)114-121
• 縮略詞表121-123
• 致謝123-125
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明125

  本文關(guān)鍵詞：NEK2與前列腺癌侵襲性和預(yù)后的相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：399775