本文關(guān)鍵詞：胚胎干細(xì)胞源性胸腺上皮祖細(xì)胞表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)性多發(fā)硬化癥的防治作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多發(fā)性硬化癥(MS)是由自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的,對(duì)髓鞘抗原免疫耐受破壞所致的自身免疫病。自身靶抗原通過與抗原提呈細(xì)胞結(jié)合觸發(fā)自身致病性CD4+Th1/Th17細(xì)胞產(chǎn)生,同時(shí)伴有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的免疫功能抑制,可能與MS發(fā)病有關(guān)。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育經(jīng)陰性選擇,自身反應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)生清除或抑制,可誘導(dǎo)抗原特異性耐受,阻止MS的發(fā)生和發(fā)展。胸腺功能減退和其內(nèi)自身抗原的不穩(wěn)定表達(dá)則影響了陰性選擇發(fā)生而限制了治療效果。因此,對(duì)MS的防治而言,耐受誘導(dǎo)不僅依賴于自身抗原在胸腺持續(xù)表達(dá),而且還與胸腺功能是否正常有關(guān)。但隨年齡增長,胸腺上皮細(xì)胞(TECs)凋亡,導(dǎo)致胸腺微環(huán)境的改變,胸腺功能逐漸退化,可引起T細(xì)胞正常發(fā)育受阻。大量研究表明,髓質(zhì)(m)TECs可表達(dá)自身組織特異性抗原(TSAs),傳遞給胸腺內(nèi)樹突狀細(xì)胞或直接提呈給發(fā)育中的T細(xì)胞,誘導(dǎo)陰性選擇,可引起抗原特異性T細(xì)胞清除,刺激抗原特異性Tregs增加,起到阻止自身免疫性疾病發(fā)生的作用,但TECs有限的數(shù)量來源極大限制了其臨床應(yīng)用。已有研究證實(shí),小鼠胚胎干細(xì)胞(m ESCs)來源的胸腺上皮祖細(xì)胞(TEPs)移植到體內(nèi),可分化為TECs,重建胸腺結(jié)構(gòu),促進(jìn)T細(xì)胞發(fā)育,這為TECs的臨床應(yīng)用提供了充足的種子細(xì)胞來源。因此,將自身致病性抗原過表達(dá)在m ESCs內(nèi),并誘導(dǎo)分化為TEPs進(jìn)行胸腺內(nèi)移植的方法,可能誘導(dǎo)自身耐受,為MS的防治提供了新的途徑,也為其它已知自身致病性抗原的自身免疫病的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。目的:本課題通過建立小鼠MS動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE),將引起MS的關(guān)鍵致病性抗原髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)過表達(dá)在m ESCs來源的TEPs(m ESC-TEPs)內(nèi),胸腺內(nèi)移植,研究其是否能分化為TECs,改善胸腺微環(huán)境,促進(jìn)T細(xì)胞發(fā)育,同時(shí)MOG在胸腺內(nèi)持續(xù)表達(dá),誘導(dǎo)針對(duì)MOG抗原的特異性耐受,達(dá)到防治MS的目的;并探討防治作用的相關(guān)機(jī)制,是否與中樞耐受(自身抗原特異性T細(xì)胞刪除或抑制)或/和外周耐受(抗原特異性Tregs增加)機(jī)制有關(guān)。方法:1.利用基因克隆和轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白GFP的重組質(zhì)粒MOG-p EF1a-IRES-Ac GFP,轉(zhuǎn)染TC-1 m ESCs,篩選獲得MOG穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株MOG/m ESCs。利用細(xì)胞因子表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子7/角質(zhì)細(xì)胞生長因子(FGF7/KGF)、FGF10和骨形成蛋白4(BMP4)聯(lián)合體外培養(yǎng),誘導(dǎo)MOG/m ESCs分化為胸腺上皮祖細(xì)胞(MOG/TEPs)。取4-6周129S6Sv Ev Tac小鼠12只,分4組,每組3只進(jìn)行胸腺內(nèi)注射:實(shí)驗(yàn)組為注射MOG/TEPs基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞組、對(duì)照組分別為注射p EF1a/TEPs空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組、MOG/聚乙烯亞胺(PEI)質(zhì)粒組和p EF1a/PEI空載體組。分別于注射后第2天、第30天和第90天取胸腺組織,Western blot、和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析比較各組胸腺移植后,m ESC-TEPs數(shù)量、分布以及綠色熒光蛋白(GFP)和MOG蛋白持續(xù)表達(dá)情況。2.建立小鼠MS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE),研究MOG/TEPs細(xì)胞胸腺內(nèi)移植對(duì)MS的預(yù)防作用。取4-6周TC-1 m ESCs同基因系129S6Sv Ev Tac小鼠35只,利用anti-Ep CAM抗體,運(yùn)用免疫磁珠分選方法對(duì)培養(yǎng)的m ESC-TEPs細(xì)胞進(jìn)行分選,獲得MOG/TEPs(Ep CAM+)和MOG/Ep CAM-細(xì)胞,分5組作小鼠胸腺內(nèi)注射:實(shí)驗(yàn)組為注射MOG/TEPs(Ep CAM+)細(xì)胞組、對(duì)照組分別為注射MOG/Ep CAM-細(xì)胞組、p EF1a/TEPs空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組、MOG/PEI質(zhì)粒組和PBS組;作為平行實(shí)驗(yàn),非同基因系的C57BL/6小鼠35只,致死量照射后,T細(xì)胞清除的骨髓(TCD-BM)移植,同時(shí)按上述5組分組進(jìn)行胸腺內(nèi)注射。8周后,MOG35-55小鼠背部皮下四點(diǎn)注射誘導(dǎo)EAE,逐日觀察模型建立和發(fā)病進(jìn)展情況,臨床評(píng)分,42天后處死小鼠。① 取脊髓組織石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅(HE)染色、盧卡斯快藍(lán)(LFB)染色和Bielschowski鍍銀(BSI)染色,觀察各組小鼠組織病理學(xué)改變并對(duì)組織切片進(jìn)行半定量評(píng)分。② 取胸腺組織,分離胸腺細(xì)胞和TECs,FACS檢測各組總胸腺細(xì)胞數(shù)、CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4+或CD8+細(xì)胞數(shù)量變化;分析各組總TECs(CD45-Ep CAM1+)、c TECs(CD45-Ep CAM1+Ly51+)和m TECs(CD45-Ep CAM1+Ly51-)細(xì)胞數(shù)量變化。③ 取脾臟組織,分離脾細(xì)胞,不同劑量MOG35-55以及anti-CD3和anti-CD28抗體刺激培養(yǎng),Brd U摻入檢測脾細(xì)胞增殖情況。④ 收集各組MOG35-55刺激培養(yǎng)脾細(xì)胞上清,CBA試劑盒標(biāo)記,FACS檢測Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子產(chǎn)物分泌情況。⑤ 收集各組小鼠血清,間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測各組小鼠血清中抗MOG抗體產(chǎn)生情況。3.建立小鼠EAE模型,研究MOG/TEPs細(xì)胞胸腺內(nèi)移植對(duì)MS的治療作用。4-6周C57BL/6小鼠15只,MOG35-55注射誘導(dǎo)EAE,逐日觀察發(fā)病及疾病進(jìn)展情況;臨床評(píng)分達(dá)1-2分后,小鼠致死量照射并TCD-BM移植,同時(shí)分三組進(jìn)行胸腺內(nèi)注射:實(shí)驗(yàn)組為注射MOG/TEPs細(xì)胞組、對(duì)照組為注射MOG/Ep CAM-細(xì)胞組和PBS組;注射后觀察至第44天,MOG35-55再次免疫誘導(dǎo)EAE,繼續(xù)進(jìn)行臨床評(píng)分,觀察至第75天,處死小鼠,取脊髓觀察各組小鼠脊髓組織病理學(xué)改變并對(duì)組織切片進(jìn)行半定量評(píng)分。結(jié)果:1.成功克隆獲得了重組質(zhì)粒MOG-p EF1a-IRES-Ac GFP;建立了MOG/m ESCs細(xì)胞模型,該細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)MOG蛋白,AP染色呈陽性,可檢測到OCT4和SSEA1干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá),NOD-SCID小鼠皮下注射后,可形成畸胎瘤;體外可成功誘導(dǎo)分化MOG/m ESCs為MOG/TEPs,該細(xì)胞陽性表達(dá)Ep CAM1、K5和K8分子,Pax1、Pax9、Plet1、Fox N1和Hox A3基因m RNA表達(dá)量明顯增加;MOG/TEPs胸腺內(nèi)移植后,體內(nèi)可分化為TECs細(xì)胞,胸腺內(nèi)不同發(fā)育階段T細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組增加,同時(shí)移植后90天仍可在胸腺內(nèi)檢測到MOG和GFP蛋白表達(dá)。2.MOG/TEPs移植對(duì)MS/EAE的動(dòng)物疾病模型具有預(yù)防發(fā)病的作用:MOG/TEPs移植后129S6Sv Ev小鼠和C57BL/6小鼠發(fā)病率、平均臨床分?jǐn)?shù)和積累評(píng)分較各對(duì)照組低,組織切片觀察,病理受損情況減輕。3.MOG/TEPs胸腺內(nèi)注射對(duì)MS/EAE模型具有治療作用:MOG/TEPs處理聯(lián)合骨髓移植后,MOG35-55再次免疫,小鼠EAE臨床評(píng)分降低,組織病理改變減輕。4.MOG35-55刺激培養(yǎng)后,MOG/TEPs處理組脾細(xì)胞增殖指數(shù)降低,IL-17、TNF和IFN-γ分泌減少,而抗CD3/CD28抗體刺激培養(yǎng)后增殖指數(shù)無明顯變化。另外,MOG/TEPs處理后,小鼠胸腺和脾臟內(nèi)CD4+CD25+Fox P3+細(xì)胞數(shù)量增加,血清MOG抗體濃度檢測無明顯變化。結(jié)論:本研究成功地將過表達(dá)MOG的m ESCs誘導(dǎo)分化為TEPs,并將該細(xì)胞移植到MS/EAE模型小鼠胸腺內(nèi),實(shí)現(xiàn)了有效預(yù)防MS/EAE模型小鼠疾病發(fā)生的目的,同時(shí)MOG/TEPs胸腺內(nèi)注射聯(lián)合骨髓造血干細(xì)胞移植對(duì)已建立的MS/EAE模型可達(dá)到長期緩解的治療作用;該防治作用的發(fā)揮可能是通過中樞耐受(抗原特異性T細(xì)胞刪除)和外周耐受(Tregs增加)機(jī)制的參與而實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：胚胎干細(xì)胞 胸腺上皮祖細(xì)胞 耐受誘導(dǎo) 多發(fā)性硬化 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎
【學(xué)位授予單位】：貴陽醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R744.51
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 英文縮略詞表17-19
• 0 引言19-23
• 1 材料與方法23-48
• 1.1 材料23-27
• 1.2 方法27-48
• 2 結(jié)果48-73
• 2.1 MOG/m ESCs 細(xì)胞株的建立及特征48-52
• 2.2 體外誘導(dǎo)分化 MOG/m ESCs 為 MOG/TEPs52-53
• 2.3 MOG/TEPs 胸腺內(nèi)移植后，隨時(shí)間延長，MOG 在胸腺內(nèi)表達(dá)情況分析53-57
• 2.4 129S6Sv Ev Tac 小鼠誘導(dǎo) EAE 模型57-58
• 2.5 MOG/TEPs 移植對(duì)同基因系 129S6Sv Ev Tac 小鼠 EAE 的預(yù)防作用58-62
• 2.6 MOG/TEPs 移植對(duì)異基因系 C57BL/6 小鼠 EAE 的預(yù)防作用62-67
• 2.7 MOG/TEPs 胸腺內(nèi)移植對(duì)已誘發(fā)的 EAE 模型有誘導(dǎo)長期緩解的治療作用67-69
• 2.8 MOG/TEPs 移植導(dǎo)致針對(duì) MOG 的抗原特異性 T 細(xì)胞增殖反應(yīng)減弱，Tregs產(chǎn)生增加69-71
• 2.9 MOG/TEPs 胸腺內(nèi)移植可引起 EAE 小鼠脾細(xì)胞 Th1/Th17 細(xì)胞因子分泌減少71-73
• 3 討論73-82
• 3.1 建立穩(wěn)定表達(dá) MOG 蛋白的細(xì)胞株 MOG/m ESCs73-74
• 3.2 體外誘導(dǎo) MOG/m ESCs 向 MOG/TEPs 分化，作胸腺內(nèi)移植，可重建胸腺結(jié)構(gòu)，支持 T 細(xì)胞發(fā)育74-75
• 3.3 MOG/m ESCs來源的MOG/TEPs胸腺內(nèi)移植支持T細(xì)胞發(fā)育同時(shí)可實(shí)現(xiàn)自身抗原MOG在胸腺內(nèi)的長期表達(dá)75-77
• 3.4 MOG35-55注射免疫，誘導(dǎo) MS/EAE 動(dòng)物模型形成77-78
• 3.5 MOG/TEPs胸腺內(nèi)注射，誘導(dǎo)耐受，對(duì)EAE的預(yù)防和治療作用78-82
• 4 結(jié)論82-83
• 參考文獻(xiàn)83-87
• 綜述87-103
• 參考文獻(xiàn)97-103
• 作者簡歷103-104
• 致謝104-106
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集106

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本文編號(hào)：397828