本文關(guān)鍵詞：癌細(xì)胞片狀偽足形成的惡性行為表型及其分子機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：癌癥的惡性程度與癌細(xì)胞的惡性行為表型密切相關(guān),癌細(xì)胞有三個(gè)基本表型特征:不死性、遷移性和失去接觸抑制。當(dāng)然,癌細(xì)胞還有許多不同于其他正常細(xì)胞的生理、生化和形態(tài)特征,如異倍體、代謝異常、耐藥等等。其中癌細(xì)胞的遷移性是其常見的惡性表型之一,而癌細(xì)胞的遷移能力直接決定了其惡性的程度。癌細(xì)胞遷移涉及到細(xì)胞粘附的減少、細(xì)胞骨架的重排、細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞突出及偽足的形成,其中癌細(xì)胞的偽足尤其是片狀偽足的形成是癌細(xì)胞遷移能力強(qiáng)弱的關(guān)鍵所在。偽足一般劃分為絲狀偽足、片狀偽足、侵襲偽足和足體。作為細(xì)胞膜的特化結(jié)構(gòu),這四種偽足有著不同的功能:絲狀偽足主要負(fù)責(zé)細(xì)胞粘附,而片狀偽足對于細(xì)胞的長距離遷移有著重要的作用。HAb18G/CD147分子作為一個(gè)腫瘤標(biāo)志物,高表達(dá)于多種癌細(xì)胞表面。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道HAb18G/CD147分子對癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有著重要的影響,但其具體的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步的闡明。因此,為了進(jìn)一步了解HAb18G/CD147分子與癌細(xì)胞惡性行為表型尤其是癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系,是否通過改變癌細(xì)胞偽足形成來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的運(yùn)動,我們利用多種細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)手段,證明了HAb18G/CD147分子通過Fak和Src的磷酸化使Cortactin分子活化,活化的Cortactin分子能夠作為支架蛋白維持Arp2/3復(fù)合物的穩(wěn)定,進(jìn)一步促使Actin在細(xì)胞前緣(Leading-edge)形成樹突狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)即片狀偽足,最終促進(jìn)癌細(xì)胞運(yùn)動能力。本研究最終闡明了HAb18G/CD147促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制。第一部分:HAb18G/CD147促進(jìn)癌細(xì)胞片狀偽足的形成介導(dǎo)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移HAb18G/CD147早已被多篇文獻(xiàn)證明能夠影響癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,不論是干涉HAb18G/CD147分子的表達(dá),還是通過抗體特異的封閉HAb18G/CD147分子的功能,都能夠抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。但是對于HAb18G/CD147分子怎樣促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,還有待深入闡述。首先,為了確認(rèn)HAb18G/CD147對癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響,我們利用穩(wěn)定干涉HAb18G/CD147的癌細(xì)胞系(knock down)和HAb18G/CD147基因敲除的癌細(xì)胞系(knock out),transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)降低或敲除HAb18G/CD147表達(dá)能夠顯著抑制癌細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞軌跡追蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí),HAb18G/CD147表達(dá)下降能夠顯著下調(diào)癌細(xì)胞的運(yùn)動速率。這些實(shí)驗(yàn)都提示我們HAb18G/CD147表達(dá)變化能夠顯著影響癌細(xì)胞的運(yùn)動能力。進(jìn)一步利用高分辨率的激光共聚焦顯微鏡通過活細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞運(yùn)動過程,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,低表達(dá)HAb18G/CD147的癌細(xì)胞在運(yùn)動過程中片狀偽足形成明顯很少,免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了此結(jié)果。本部分的研究結(jié)論:HAb18G/CD147表達(dá)下降能夠顯著降低癌細(xì)胞的運(yùn)動能力,而這種影響的主要表現(xiàn)就是癌細(xì)胞片狀偽足形成的減少。第二部分:HAb18G/CD147影響癌細(xì)胞片狀偽足形成的分子機(jī)制為了揭示HAb18G/CD147促進(jìn)癌細(xì)胞片狀偽足形成的分子機(jī)制,我們首先利用第一部分構(gòu)建的HAb18G/CD147穩(wěn)轉(zhuǎn)干涉的癌細(xì)胞系(knock down)和HAb18G/CD147基因敲除癌細(xì)胞系(knock out),通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測了與片狀偽足形成相關(guān)分子的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147表達(dá)下降并沒有影響片狀偽足形成相關(guān)分子的表達(dá)水平,卻影響了Fak、Src和Cortactin的酪氨酸磷酸化水平。使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)分別檢測HAb18G/CD147、Fak、Src和Cortactin之間的兩兩相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147與Fak、Fak與Src、Src與Cortactin分別能夠兩兩相互作用。進(jìn)一步通過點(diǎn)突變Cortactin的酪氨酸位點(diǎn),活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察及侵襲小室實(shí)驗(yàn)確定了Cortactin的酪氨酸磷酸化是片狀偽足形成的關(guān)鍵。通過以上結(jié)果我們得出結(jié)論:HAb18G/CD147表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞片狀偽足的形成是通過HAb18G/CD147、Fak、Src和Cortactin分子間的逐級磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。第三部分:HAb18G/CD147促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究本部分研究的目的是通過一系列的動物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)證明HAb18G/CD147對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響,以及通過收集臨床病例,分析HAb18G/CD147與癌癥病人的TNM分期的關(guān)系。我們通過經(jīng)尾靜脈注射癌細(xì)胞的方法構(gòu)建裸鼠轉(zhuǎn)移模型,到達(dá)時(shí)間點(diǎn)處死解剖裸鼠,取肺臟及肝臟進(jìn)行HE染色,發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147對于癌細(xì)胞的肝臟轉(zhuǎn)移有顯著影響;通過雙光子顯微鏡觀察也印證了這一結(jié)果,這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都提示我們HAb18G/CD147對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。另外,我們又通過收集臨床病例,分析了HAb18G/CD147與癌癥病人的TNM分期的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147與癌癥病人的TNM分期有相關(guān)性;這些臨床病例分析結(jié)果也證明HAb18G/CD147分子促進(jìn)了癌的進(jìn)展。綜上所述,HAb18G/CD147的表達(dá)變化能夠顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的運(yùn)動能力,而這種影響的主要表現(xiàn)就是能夠影響癌細(xì)胞片狀偽足的形成。并且HAb18G/CD147表達(dá)變化促進(jìn)癌細(xì)胞的片狀偽足形成是通過HAb18G/CD147、Fak、Src及Cortactin分子間的逐級磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床病例分析結(jié)果也證明HAb18G/CD147促進(jìn)了癌的進(jìn)展。
【關(guān)鍵詞】：癌細(xì)胞 片狀偽足 HAb18G/CD147 Cortactin Fak Src 細(xì)胞運(yùn)動 細(xì)胞前緣
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-33
• 第一部分 HAB18G/CD147促進(jìn)癌細(xì)胞片狀偽足的形成介導(dǎo)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移33-52
• 引言33
• 1 材料33-37
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)器材33-34
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑34-35
• 1.3 主要緩沖液35-36
• 1.4 細(xì)胞系36-37
• 2 方法37-41
• 2.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)37
• 2.2 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)37-38
• 2.3 腫瘤細(xì)胞增殖活力檢測實(shí)驗(yàn)38-39
• 2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞增周期實(shí)驗(yàn)39
• 2.5 transwell侵襲小室檢測細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)39-40
• 2.6 活細(xì)胞培養(yǎng)觀察細(xì)胞運(yùn)動軌跡實(shí)驗(yàn)40
• 2.7 活細(xì)胞培養(yǎng)觀察細(xì)胞片狀偽足形成能力實(shí)驗(yàn)40
• 2.8 免疫熒光染色觀察片狀偽足形成及定位實(shí)驗(yàn)40-41
• 2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析41
• 3 結(jié)果41-50
• 4 討論50-52
• 第二部分 HAB18G/CD147影響癌細(xì)胞片狀偽足形成的分子機(jī)制52-75
• 引言52
• 1.材料52-55
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)器材52-53
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑53-54
• 1.3 主要緩沖液54-55
• 1.4 主要質(zhì)粒載體55
• 2.方法55-66
• 2.1 蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)55-56
• 2.2 熒光蛋白質(zhì)粒小量提取實(shí)驗(yàn)56-57
• 2.2 提取人腫瘤細(xì)胞內(nèi)Total RNA57-58
• 2.3 total RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA58-59
• 2.4 基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)（以Cortactin為例）59-60
• 2.5 瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物60-61
• 2.6 Cortactin的PCR和T-vector連接61-62
• 2.7 Dsred1-N1載體、p EGFP載體與Cortactin T載體的酶切連接62-64
• 2.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、挑單克隆及鑒定64
• 2.9 si RNA干涉64-65
• 2.10 熒光能量共振轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（以HAb18G/CD147與Cortactin為例）65
• 2.11 Cortactin熒光表達(dá)載體點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)65-66
• 2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析66
• 3.結(jié)果66-73
• 4.討論73-75
• 第三部分 HAB18G/CD147促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究及其臨床意義75-85
• 引言75
• 1.材料75-76
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)器材75-76
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑76
• 1.3 主要緩沖液76
• 2.方法76-79
• 2.1 尾靜脈注射癌細(xì)胞構(gòu)建裸鼠轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)76-77
• 2.2 HE染色實(shí)驗(yàn)77-78
• 2.3 免疫組化染色實(shí)驗(yàn)78
• 2.4 雙光子顯微鏡直接觀察裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移灶78
• 2.5 臨床樣本免疫組化染色結(jié)果評分判定78-79
• 2.6 臨床樣本統(tǒng)計(jì)分析79
• 3.結(jié)果79-84
• 4.討論84-85
• 小結(jié)85-86
• 參考文獻(xiàn)86-95
• 個(gè)人簡歷和研究成果95-97
• 致謝97

  本文關(guān)鍵詞：癌細(xì)胞片狀偽足形成的惡性行為表型及其分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：397253