本文關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌中TGF-β經(jīng)典信號通路相關(guān)基因的miRNA表觀調(diào)控機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【研究背景與目的】肺癌是全球范圍內(nèi)最為常見的癌癥之一,其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)占大部分(85%)。遺傳因素是腫瘤發(fā)生的重要原因。轉(zhuǎn)化生長因子-beta信號通路(TGF-βsignaling pathway)能夠調(diào)節(jié)從胚胎發(fā)育到組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等一系列的生物功能。而TGF-β信號通路的紊亂對于非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展都起到關(guān)鍵的作用。該通路中各組分在癌癥發(fā)生發(fā)展中的異常表達(dá)是導(dǎo)致TGF-β信號通路紊亂的主要原因,其中膜受體TGFβR1和轉(zhuǎn)錄因子SMAD4是TGF-β信號級聯(lián)傳遞的關(guān)鍵蛋白。研究發(fā)現(xiàn)他們在非小細(xì)胞肺癌中頻繁下調(diào)表達(dá)。由于二者在NSCLC中突變頻率很低,所以表觀機(jī)制可能是其異常表達(dá)的潛在原因之一。mi RNA在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達(dá)起調(diào)控作用,人類中大部分基因的表達(dá)受到mi RNA的靶向直接調(diào)控。預(yù)測分析顯示TGFβR1和SMAD4也可以受到mi RNA的調(diào)控,本研究旨在探討NSCLC中TGFβR1和SMAD4異常表達(dá)的mi RNA調(diào)控機(jī)制,闡明mi RNA在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的重要作用,為NSCLC的早期診斷和治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)�！狙芯糠椒ā�1)實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測m RNA和mi RNAs的表達(dá),western blot檢測蛋白的表達(dá)情況;2)雙熒光報(bào)告載體技術(shù)檢測mi RNA與轉(zhuǎn)錄本3’UTR預(yù)測位點(diǎn)的靶向作用關(guān)系;3)利用慢病毒載體構(gòu)建技術(shù)方法培養(yǎng)和篩選mi R-142-3p穩(wěn)定過表達(dá)和沉默細(xì)胞株;4)利用細(xì)胞計(jì)數(shù)或CCK-8細(xì)胞增殖檢測技術(shù)來檢測細(xì)胞的增殖能力變化;5)利用Transwell細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞侵襲能力的變化;6)運(yùn)用Mass ARRAY#174;飛行質(zhì)譜技術(shù)定量檢測分析mi R-205啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化情況。【研究內(nèi)容】第一部分mi R-142-3p靶向抑制TGFβR1從而阻斷TGF-β誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌生長抑制作用對NSCLC細(xì)胞株和組織中mi R-142-3p和TGFβR1基因的表達(dá)情況進(jìn)行q RT-PCR或western blot檢測分析發(fā)現(xiàn),相對于正常支氣管上皮細(xì)胞HBE,在NSCLC細(xì)胞株中TGFβR1 m RNA和蛋白下調(diào)表達(dá),而mi R-142-3p上調(diào)表達(dá);相對于癌旁組織,在NSCLC組織中TGFβR1 m RNA顯著下調(diào)表達(dá),mi R-142-3p上調(diào)表達(dá),并且TGFβR1 m RNA與mi R-142-3p表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。GEO芯片數(shù)據(jù)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,表明TGFβR1與mi R-142-3p在NSCLC中差異表達(dá)是一個(gè)普遍現(xiàn)象,并且mi R-142-3p可能是導(dǎo)致TGFβR1表達(dá)下調(diào)的原因之一。通過Target Scan對TGFβR1進(jìn)行預(yù)測分析,表明mi R-142-3p可能靶向作用TGFβR1 3’UTR特異序列。通過mi RNA mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞發(fā)現(xiàn),mi R-142-3p可以顯著下調(diào)TGFβR1 m RNA和蛋白表達(dá),且其抑制物Anti-mi R-142-3p可以顯著上調(diào)TGFβR1 m RNA和蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步的雙熒光報(bào)告載體活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGFβR1是mi R-142-3p直接調(diào)控的靶基因。我構(gòu)建并篩選了mi R-142-3p穩(wěn)定上調(diào)表達(dá)和穩(wěn)定沉默的A549細(xì)胞株。進(jìn)一步觀察mi R-142-3p對TGF-β通路及其生物學(xué)功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mi R-142-3p顯著抑制了TGF-β通路活性,表現(xiàn)在通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子p-SMAD3的活性的下降。不僅如此,mi R-142-3p還阻斷了TGF-β通路所誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制作用,表現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子p21的下調(diào)表達(dá)。另一方面,mi R-142-3p抑制了TGF-β誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞的EMT和侵襲能力。第二部分mi R-205靶向抑制SMAD4表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖對NSCLC組織中mi R-205和SMAD4的表達(dá)情況進(jìn)行q RT-PCR檢測分析發(fā)現(xiàn),相對于癌旁組織,在NSCLC組織中SMAD4 m RNA顯著下調(diào)表達(dá),mi R-205顯著上調(diào)表達(dá),并且SMAD4 m RNA與mi R-205表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。GEO芯片數(shù)據(jù)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,表明SMAD4與mi R-205在NSCLC中差異表達(dá)較為頻繁,并且mi R-205可能是導(dǎo)致SMAD4表達(dá)下調(diào)的原因之一。通過Target Scan對SMAD4進(jìn)行預(yù)測分析,表明mi R-205可能靶向作用SMAD43’UTR特定序列。通過mi RNA mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞發(fā)現(xiàn),mi R-205可以顯著下調(diào)SMAD4 m RNA和蛋白表達(dá),利用雙熒光報(bào)告載體活性檢測證實(shí)了SMAD4是mi R-205直接調(diào)控的靶基因。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明,mi R-205可以顯著增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞株的增殖能力,并且瞬時(shí)沉默SMAD4也可以達(dá)到相同的作用,表明mi R-205可以通過抑制SMAD4的表達(dá)來促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖能力。針對mi R-205啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況的檢測分析發(fā)現(xiàn),其-77Cp G位點(diǎn)的甲基化頻率在NSCLC組織中顯著低于癌旁組織,表明這可能是導(dǎo)致mi R-205在NSCLC中上調(diào)表達(dá)的原因之一。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 微小RNA 轉(zhuǎn)化生長因子-β
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-15
• 第二章 材料與方法15-39
• 1 材料15-21
• 1.1 細(xì)胞株15
• 1.2 臨床組織樣本15
• 1.3 菌株和質(zhì)粒載體15-16
• 1.4 試劑16-20
• 1.5 生物信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫20
• 1.6 主要儀器20-21
• 2 方法21-39
• 2.1 生物信息學(xué)方法21-22
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 2.3 RNA定量檢測23-27
• 2.4 蛋白提取及表達(dá)檢測27-29
• 2.5 載體構(gòu)建29-35
• 2.6 miR1423p穩(wěn)定過表達(dá)和沉默細(xì)胞株的建立35-37
• 2.7 MassArray甲基化檢測37-38
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法38-39
• 第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-59
• 第一部分 miR1423p靶向抑制TGFβR1從而阻斷TGF-β誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌生長抑制作用39-52
• 1.1 TGFβR1與miR1423p在NSCLC細(xì)胞與組織中的表達(dá)情況39-43
• 1.2 miR1423p靶向抑制TGFβR143-46
• 1.3 miR1423p對TGF-β/SMAD經(jīng)典信號通路的抑制作用46-48
• 1.4 miR1423p對TGF-β誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞增殖抑制作用的影響48-50
• 1.5 miR1423p對TGF-β誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞EMT的影響50-51
• 1.6 小結(jié)51-52
• 第二部分 miR-205靶向抑制SMAD4表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖52-59
• 2.1 SAMD4與miR-205在NSCLC中的表達(dá)情況52-54
• 2.2 miR-205靶向抑制SMAD454-56
• 2.3 miR-205通過抑制SMAD4表達(dá)來促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖56-57
• 2.4 NSCLC中miR-205高表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)低甲基化頻率相關(guān)57-58
• 2.5 小結(jié)58-59
• 第四章討論59-62
• 全文總結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 綜述70-87
• 參考文獻(xiàn)78-87
• 攻讀博士期間發(fā)表論文87-88
• 附錄：英文縮略詞表88-90
• 致謝90-91

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳萬青;張思維;曾紅梅;鄭榮壽;鄒小農(nóng);趙平;吳良有;李光琳;赫捷;;中國2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J];中國腫瘤;2014年01期

  本文關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌中TGF-β經(jīng)典信號通路相關(guān)基因的miRNA表觀調(diào)控機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：396752