發(fā)展高靈敏和高特異性的分子探針用于生化分析、腫瘤的早期診斷及治療具有重大意義。然而在實際工作中常常出現(xiàn)以下兩個問題:(1)對于檢測靶標(biāo)含量較低的生物樣品,常因靈敏度不夠而檢測不到,從而出現(xiàn)假陰性信號;(2)復(fù)雜生物檢測環(huán)境的干擾如血清乃至細(xì)胞中酶等對探針的降解、非靶分子對探針的激活,基于單靶標(biāo)識別而構(gòu)建的檢測體系引起的脫靶效應(yīng)等,從而造成假陽性信號。免酶(特指免蛋白酶)核酸電路作為一種基于核酸雜交的信號放大形式,它將所需要的信息編碼在設(shè)計好的核酸序列中,在各種靶標(biāo)如核酸,蛋白質(zhì),小分子等的觸發(fā)下啟動一系列的雜交反應(yīng),最終輸出信號。它不需要蛋白酶的參與、恒溫、反應(yīng)條件溫和,因此在生物醫(yī)學(xué)中顯示出獨特優(yōu)勢及重要應(yīng)用價值。基于此,本論文針對上述存在的“假陰性”和“假陽性”兩大關(guān)鍵性問題,以提高探針在復(fù)雜生物環(huán)境中的靈敏度、抗干擾能力和精準(zhǔn)度,以及構(gòu)建診療一體化探針為目標(biāo),利用免酶核酸放大電路為主要檢測手段,結(jié)合金納米顆粒(AuNPs)比色、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)等技術(shù),設(shè)計和構(gòu)建多種新型檢測探針及分析方法,用于重要生物分子的高靈敏、高特異性檢測,以及腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)鑒別和殺傷。具體研究內(nèi)...

【文章頁數(shù)】：144 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
本文所用英文縮寫詞表
第1章 緒論
    1.1 核酸電路概述
        1.1.1 核酸電路的定義及性質(zhì)
        1.1.2 核酸電路的分類
    1.2 核酸電路的主要應(yīng)用
        1.2.1 核酸電路在分析傳感中的應(yīng)用
        1.2.2 核酸電路在腫瘤治療中的應(yīng)用
    1.3 本文構(gòu)思
第2章 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驅(qū)動的金顆粒組裝用于比色放大檢測DNA
    2.1 前言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 試劑與儀器
        2.2.2 緩沖溶液的制備
        2.2.3 探針準(zhǔn)備
        2.2.4 金納米顆粒的合成與表征
        2.2.5 金納米顆粒的修飾
        2.2.6 瓊脂糖電泳分析
        2.2.7 比色分析檢測DNA
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 實驗原理
        2.3.2 不同粒徑AuNPs的表征及優(yōu)化
        2.3.3 可行性考察
        2.3.4 靈敏度考察
        2.3.5 特異性考察
    2.4 小結(jié)
第3章 催化發(fā)夾組裝驅(qū)動的金顆粒組裝用于高靈敏比色檢測腺苷
    3.1 前言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 試劑與儀器
        3.2.2 緩沖溶液的配制
        3.2.3 AuNPs的合成及修飾
        3.2.4 瓊脂糖凝膠電泳表征
        3.2.5 比色分析傳感
        3.2.6 TEM成像
        3.2.7 細(xì)胞裂解液的制備
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 實驗原理與電泳驗證
        3.3.2 AuNPs的合成及修飾
        3.3.3 DNA觸發(fā)的CHA的檢測性能
        3.3.4 腺苷檢測的探針濃度優(yōu)化
        3.3.5 腺苷檢測的靈敏度及特異性考察
        3.3.6 復(fù)雜樣品中的檢測
    3.4 小結(jié)
第4章 催化發(fā)夾組裝-雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)級聯(lián)用于高靈敏檢測DNA及腺苷
    4.1 前言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 試劑與儀器
        4.2.2 緩沖溶液的配制
        4.2.3 瓊脂糖凝膠電泳分析
        4.2.4 熒光光譜測量
        4.2.5 HPLC測定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 實驗原理
        4.3.2 分步電路驗證
        4.3.3 CHA-HCR級聯(lián)電路檢測DNA
        4.3.4 二元探針,HCR電路,級聯(lián)電路檢測性能比較
        4.3.5 CHA-HCR級聯(lián)電路檢測腺苷
    4.4 小結(jié)
第5章 雙miRNA調(diào)控的脫氧核酶-雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)級聯(lián)用于癌細(xì)胞的精準(zhǔn)識別
    5.1 前言
    5.2 實驗部分
        5.2.1 試劑與儀器
        5.2.2 緩沖溶液的配制
        5.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與探針的轉(zhuǎn)染
        5.2.4 瓊脂糖凝膠電泳表征
        5.2.5 熒光分析
        5.2.6 共聚焦成像
        5.2.7 流式細(xì)胞術(shù)分析
        5.2.8 反轉(zhuǎn)錄PCR分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 實驗原理
        5.3.2 信號激活式核酶電路的驗證
        5.3.3 基于FRET的 HCR電路驗證
        5.3.4 級聯(lián)邏輯電路的驗證
        5.3.5 級聯(lián)電路用于腫瘤細(xì)胞的成像考察
        5.3.6 級聯(lián)電路用于腫瘤細(xì)胞的流式特異性考察
    5.4 小結(jié)
第6章 雙RNA控制的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-脫氧核酶級聯(lián)用于癌細(xì)胞的精準(zhǔn)診斷及基因治療
    6.1 前言
    6.2 實驗部分
        6.2.1 試劑與儀器
        6.2.2 緩沖溶液的配制
        6.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與探針的轉(zhuǎn)染
        6.2.4 瓊脂糖凝膠電泳表征
        6.2.5 熒光分析
        6.2.6 FBS中穩(wěn)定性考察
        6.2.7 共聚焦成像
        6.2.8 反轉(zhuǎn)錄PCR分析
        6.2.9 Western blot分析
        6.2.10 MTS分析
        6.2.11 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 實驗原理
        6.3.2 HCR電路表征
        6.3.3 10-23核酶切割電路的驗證
        6.3.4 細(xì)胞內(nèi)miR-21成像
        6.3.5 EGR-1mRNA切割誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的驗證
        6.3.6 雙RNA控制的基因治療的特異性
    6.4 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
附錄 攻讀博士學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號：3949434