本文關鍵詞：動脈粥樣硬化中血管細胞粘附分子-1的表達與基因干預研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景目的隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高,動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)相關性疾病已成為威脅人類健康的主要殺手,AS是一種系統(tǒng)性疾病,病變常同時累及全身大中動脈血管,主要表現(xiàn)為動脈管壁脂質(zhì)及纖維基質(zhì)堆積,管腔狹窄。AS也是冠狀動脈性心臟病(coronary heart disease, CHD)的主要病理類型。AS的病因及確切發(fā)病機制目前尚不清楚,現(xiàn)有的研究證實炎癥反應在AS的發(fā)展過程中起重要作用。根據(jù)“損傷-反應”和慢性炎癥學說,各種AS危險因素可以導致動脈內(nèi)皮細胞(endothelial cell, EC)損傷,隨后EC表達細胞粘附分子(cell adhesion molecules)增加,如血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1).細胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule, ICAM)、血小板-內(nèi)皮細胞粘附分子-1(platelet-endothelid cell adhesion molecule-1, PEC AM-1)等,趨化血液單核細胞及T淋巴細胞粘附。單核細胞及T淋巴細胞進入內(nèi)膜下啟動炎性反應,分泌一系列細胞因子,如白細胞介素(interleukin, IL)、單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein, MCP)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)等,這些細胞因子可進一步激活EC、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)及巨噬細胞,促進粥樣斑塊的發(fā)生、發(fā)展。VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族,其分子量為100-1 10KD,配體是分布于白細胞表面的VLA-4分子。VCAM-1在血管內(nèi)皮細胞上表達,可以促進白細胞和血管內(nèi)皮細胞的粘附,加速白細胞向血管內(nèi)皮下游走,并能促進SMC的增殖,因此認為VCAM-1在AS中發(fā)揮重要作用,加速了AS的發(fā)生發(fā)展過程。內(nèi)皮細胞表面的VCAM-1可以脫落進入血液形成可溶性VCAM-1 (soluble vascular cell adhesion molecule-1, sVCAM-1)。因為直接測定血管內(nèi)皮組織中的VCAM-1相對困難,目前國內(nèi)外研究多通過測定血液中的sVCAM-1作為測定VCAM-1的間接指標。Hackmen等研究發(fā)現(xiàn)高TG患者血液中sVCAM-1水平上升。為了進一步明確VCAM-1與CAD的關系,本研究選擇行主動脈-冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass graft, CABG)時廢棄的主動脈管壁組織,應用免疫組化檢測VCAM-1表達,探討人體動脈組織VCAM-1表達與AS發(fā)病機制的關系。材料方法1.研究對象(1)對象：選取2008年12月至2012年2月在山東大學附屬千佛山醫(yī)院行CABG患者36例,其中男性27例,女性9例,年齡為48-78歲,平均63.6±9.2歲。36例CABG患者中合并吸煙者6例,高血壓15例,糖尿病12例。對照組為12例腎臟移植手術供體者,均為男性,年齡為34-52歲,平均39.4±4.5歲。入院后經(jīng)查體排除各種明顯器質(zhì)性疾病。(2)標本：研究組患者行CABG時留取廢棄的全層主動脈組織,36例CABG取得動脈組織56塊。對照組供體者行腎臟移植手術時留取廢棄的腎動脈組織,12例腎臟移植取得動脈組織46塊。2.生化分析所有研究組患者及對照組成員均于清晨空腹采靜脈血6m1,于山東大學附屬千佛山醫(yī)院中心實驗室測定靜脈血漿總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、血清甘油三酯(triglycerides,TG)及脂蛋白(a) [lipoprotein (a), Lp(a)]、載脂蛋白A (apolipoprotein, ApoA)、脂蛋白B (apolipoprotein B, ApoB)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin, IBIL)等生化指標。3.冠狀動脈造影及冠狀動脈Gensini積分測定所有研究組患者均行冠狀動脈造影(coronary angiography, CAG),對造影結果進行錄像并刻錄光盤,由兩位介入心血管病專家分析圖像。通過目測法判定冠狀動脈狹窄程度。應用冠狀動脈Gensini積分方法評價冠狀動脈病變嚴重程度。4.標本采集及免疫組化研究組36例患者行CABG手術時留取其打孔廢棄的主動脈壁全層組織,對照組為12例腎移植供體者移植時修剪廢棄的動脈組織。上述組織獲取后,立即儲存于-80℃冰箱內(nèi)備用。兩組動脈管壁組織標本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定、梯度酒精脫水、二甲苯脫酒精、石蠟包埋、切片。選擇多聚賴氨酸進行載玻片防脫片處理,切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化,檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復,3%雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,加入兔抗人VCAM-1多克隆抗體(1：300),4℃冰箱孵育過夜,加入酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物,室溫孵育30min, DAB顯色,鏡下控制顯色時間,蘇木素復染、分化、返藍、梯度酒精脫水、二甲苯脫酒精、晾干、中性樹脂封片。免疫組化染色切片經(jīng)顯微圖像分析系統(tǒng)檢測,每張切片隨機選取3個高倍視野,測定每個視野中陽性信號的平均光密度值(optical density, OD),取其平均值即為VCAM-1相對表達量。5.統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。測定數(shù)值以均數(shù)±標準差(x±s)表示,計量資料均數(shù)組間比較采用t檢驗,兩變量之間相關性采用直線相關分析P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.研究組及對照組一般情況比較研究組患者36例均行CABG,其中男性27例,女性9例,年齡為46-78歲,平均63.6±9.2歲。36例CABG患者中合并吸煙者6例,高血壓15例,糖尿病12例。對照組為12例腎臟移植手術供體者,均為男性,年齡為34-52歲,平均39.4±4.5歲。入院后經(jīng)查體排除各種明顯器質(zhì)性疾病。2.生化指標：研究組36例患者血漿TC. LDL-C及Lp(a). ApoB. TG測定值較正常參考值顯著升高,P0.05；血漿HDL-C及ApoA測定值與正常參考值相比明顯降低,P0.01；研究組患者血漿TBIL及IBIL測定值較正常參考值顯著降低,P0.05；血漿DBIL測定值雖然較正常參考值降低,但差異未達到統(tǒng)計學意義,P0.05。2.CAG研究組36例患者行CAG結果顯示冠狀動脈均有不同程度的鈣化、狹窄和迂曲,其中LM病變14例,三支病變14例,二支病變合并LAD近端病變8例；合并慢性閉塞病變4例。研究組36例患者冠狀動脈Gensini積分為24-128,平均66.64±29.11。3.動脈組織中VCAM-1表達情況研究組36例患者主動脈組織免疫組化檢測均有不同程度的VCAM-1表達,主動脈組織VCAM-1表達量為0.14-0.400D,平均0.21±0.050D。VCAM-1陽性表達著色主要分布于內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的胞漿,表現(xiàn)為棕褐色,染色分布不均勻,呈顆粒狀、片狀、簇狀或條狀。對照組12例動脈組織常規(guī)病理組織學檢查無異常,免疫組化檢測動脈組織VCAM-1表達量為0.06-0.10OD,平均0.08±0.030D,研究組和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義,P0.05。4.研究組主動脈組織VCAM-1表達量與AS主要危險因素的關系研究組36例患者主動脈組織VCAM-1表達量男性為0.21±0.040D,女性為0.20±0.070D,男女之間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；吸煙者為0.27±0.050D,非吸煙者為0.15±0.040D,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；高血壓患者為0.23±0.060D,非高血壓患者為0.19±0.040D,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；糖尿病患者為0.27±0.080D,非糖尿病患者為0.19±0.020D,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.研究組主動脈組織VCAM-1表達量與血脂水平相關性分析研究組36例患者主動脈組織VCAM-1表達量分別與TG、TC、LDL-C、 HDL-C、Lp(a)、ApoAI、ApoB行線性相關分析,結果提示VCAM-1表達量與TG、TC、LDL-C、Lp(a)、ApoB呈正相關,P0.05。VCAM-1表達量與HDL-C. ApoA、TBIL、DBIL、IBIL測定值負相關,P0.05。6.研究組主動脈組織VCAM-1表達量與冠狀動脈Gensini積分相關性分析研究組36例患者主動脈組織VCAM-1表達量與冠狀動脈Gensini積分相關性分析,結果提示VCAM-1表達量與冠狀動脈Gensini積分呈正相關(r=0.431,P0.05)。結論1.本研究顯示,研究組36例CAGB患者主動脈組織免疫組化檢測VCAM-1表達量平均為0.21±0.050D,而對照組12例腎移植廢棄的動脈組織免疫組化檢測VCAM-1表達量平均為0.08±0.030D,研究組VCAM-1表達量較對照組明顯增高,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.研究組36例CABG患者冠狀動脈造影顯示,其Gensini積分平均為66.64±29.11,與主動脈組織免疫組化檢測VCAM-1的表達量呈正相關。3. CABG患者主動脈組織中VCAM-1表達水平與血漿TG, TC、LDL-C、 LP(a)、ApoB呈正相關,與血漿HDL-C、ApoA呈負相關。4.本研究組患者有吸煙、高血壓、糖尿病等病史,較沒有吸煙、高血壓、糖尿病等病史的患者,其主動脈組織中VCAM-1表達量顯著增高。背景：動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)相關性疾病日益成為人類健康的最主要威脅,在許多國家由于AS所導致的心血管疾病已成為首位死亡原因。AS是一種主要累及大動脈和中動脈的慢性進展性疾病,在動脈內(nèi)皮下形成斑塊,造成管腔的狹窄和動脈內(nèi)血栓形成,最終導致嚴重的臨床后果。目前的研究均發(fā)現(xiàn)AS的發(fā)生、發(fā)展過程中有大量的炎性細胞的參與并分泌多種炎性介質(zhì),炎癥學說得到大多數(shù)學者公認。血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)在AS的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。在動脈硬化發(fā)生的早期,白細胞的粘附、聚集是一個非常重要的環(huán)節(jié),正常的血管內(nèi)皮不與白細胞粘附,但在動脈硬化部位白細胞粘附于內(nèi)膜表面,并穿過內(nèi)皮細胞間連接進入到內(nèi)膜。內(nèi)皮細胞表面表達的粘附分子參與了白細胞進入內(nèi)膜的過程。VCAM-1在血管內(nèi)皮細胞上表達,可以促進白細胞和血管內(nèi)皮細胞的粘附,加速白細胞向血管內(nèi)皮下游走,并能促進SMC的增殖,因此認為VCAM-1在AS中發(fā)揮重要作用,加速了AS的發(fā)生發(fā)展過程。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNA(double stranded, dsRNA)介導的基因沉默現(xiàn)象。當一段與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)相同的dsRNA被導入細胞時,該mRNA就會發(fā)生降解,造成基因在轉(zhuǎn)錄或翻譯的環(huán)節(jié)發(fā)生阻斷而抑制基因的表達,引起基因沉默。RNAi目前作為一種替代基因敲除的研究工具得到廣泛的應用。目前RNAi技術中常使用的dsRNA載體有兩種,一種是非病毒載體,主要指攜帶dsRNA的質(zhì)粒,其主要的缺點是轉(zhuǎn)染率較低。另一種dsRNA載體為病毒載體,其中,慢病毒載體應用最為廣泛,其優(yōu)點是基因表達穩(wěn)定、基因轉(zhuǎn)移高效、免疫原性小、生物安全性高等。慢病毒載體介導的干擾導致的靶基因活性改變最為穩(wěn)定,且最為持久。目的：本研究利用載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)構建AS模型,并通過慢病毒介導的RNAi技術使ApoE-/-小鼠的VCAM-1基因沉默,觀察VCAM-1在AS進展中所起的作用,為AS的治療提供思路。材料方法：1.動物模型制備共30支雄性8周齡ApoE-/-小鼠,體重20g-25g,給予高脂飼料飼養(yǎng)。4周后,小鼠被隨機分為對照組和基因干預組,每組15只。對照組小鼠經(jīng)股靜脈注射空載體慢病毒懸液(1x108 TU/ml,20ul),基因干預組小鼠經(jīng)股靜脈注射VCAM-1干擾慢病毒懸液(1x108TU/ml,20ul)。注射慢病毒4周后,腹腔注射10%水合氯醛0.1ml將小鼠麻醉,將小鼠四肢固定在鼠板上,用剪刀剪開胸前皮膚,并剪斷胸骨,使心臟暴露。經(jīng)右心房穿刺抽取靜脈血1.5m1。用眼科剪將右心耳剪開一缺口,用輸液器針頭從心尖處插入約2mm,應用無菌生理鹽水灌流沖洗心腔及主動脈血管,直到肝臟及肺臟顏色由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色或白色,停止灌流。小心剝離心臟和全程主動脈,于髂動脈處將其完整剪下。由升主動脈處剪下心臟,剪去心臟心尖部分,于冰凍切片機內(nèi)包埋于OCT中,包埋好的組織于冰凍切片機中連續(xù)切片,置于-20℃冰箱中保存。剩余主動脈組織置于-20℃冰箱中保存。2.血脂測定ApoE-/-小鼠麻醉后固定于鼠板上,剪開胸腔,經(jīng)右心房采取靜脈血1.5m1,離心分離血清,應用生化自動分析儀測定血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、血清甘油三酯(triglycerides, TG)水平。3. Western Blot利用Western Blot方法檢測對照組及基因沉默組小鼠主動脈組織VCAM-1蛋白表達水平。4.組織學分析小鼠主動脈根部組織經(jīng)OCT包埋機包埋后切片。組織切片分別進行HE染色、油紅O染色及巨噬細胞MOMA-2染色。5.數(shù)據(jù)分析利用統(tǒng)計分析軟件SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)值變量用均數(shù)士標準差(x士s)來表示,計量資料之間的均數(shù)比較采用t檢驗,以P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果：1.小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染慢病毒的安全性經(jīng)股靜脈向ApoE-/-小鼠體內(nèi)注射慢病毒懸液或空載體慢病毒懸液后,觀察小鼠進食、飲水狀況,未發(fā)現(xiàn)異�，F(xiàn)象,兩組小鼠均未發(fā)生死亡。試驗結束前稱重,兩組小鼠間體重并未見明顯差異(P0.05)。2. ApoE-/-小鼠主動脈組織的VCAM-1蛋白表達水平Western Blot檢測ApoE-A小鼠主動脈組織中VGAM-1蛋白質(zhì)含量,結果顯示與對照組小鼠相比,基因沉默組ApoE-/-小鼠主動脈組織中VCAM-1蛋白水平明顯下降(P0.05)。3. VCAM-1基因沉默對ApoE-/-小鼠血脂的影響處死前取靜脈血檢測兩組ApoE-/-小鼠血液中的TC、LDL-C、HDL-C及TG水平,結果表明兩組小鼠間TC、LDL-C、HDL-C及TG水平無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。4. VCAM-1基因沉默對主動脈AS斑塊的影響HE染色顯示,VCAM-1基因沉默組小鼠主動脈AS斑塊面積相比對照組顯著減少(P0.05)。脂質(zhì)油紅O染色顯示,相比對照組,ApoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊中的脂質(zhì)含量明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。巨噬細胞MOMA-2染色顯示,VCAM-1基因沉默組小鼠斑塊內(nèi)巨噬細胞含量相比對照組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：1.利用慢病毒介導的RNAi技術可以安全而有效地使ApoE-/-小鼠的VCAM-1基因沉默。2. VCAM-1基因沉默后,ApoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊體積明顯減小,且斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量明顯減少。3. ApoE-/-小鼠動脈AS斑塊內(nèi)巨噬細胞減少,可能是VCAM-1基因沉默使AS病變減輕的機制。
【關鍵詞】：人類 活體 動脈粥樣硬化 血管細胞粘附分子-1 冠狀動脈旁路移植術 免疫組織化學 VCAM-1 基因沉默 RNA干擾 動脈粥樣硬化斑塊
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 第一部分6-74
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符號說明17-20
• 前言20-24
• 材料方法24-33
• 結果33-36
• 討論36-50
• 結論50-51
• 創(chuàng)新點局限性51-52
• 附表附圖52-64
• 參考文獻64-74
• 第二部分74-110
• 中文摘要74-78
• 英文摘要78-81
• 前言81-83
• 材料方法83-90
• 結果90-91
• 討論91-98
• 結論98-99
• 創(chuàng)新點局限性99-100
• 附表附圖100-104
• 參考文獻104-110
• 致謝110-111
• 在讀期間發(fā)表論文111-112
• 學位論文評閱及答辯情況表112-114
• SCI文章Ⅰ114-134
• SCI文章Ⅱ134-161

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 朱平,李小鷹,石懷銀,韋立新;心血管病患者尸檢中主動脈粥樣硬化與冠狀動脈粥樣硬化程度的相關性分析[J];中華心血管病雜志;2004年06期

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  本文關鍵詞：動脈粥樣硬化中血管細胞粘附分子-1的表達與基因干預研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：393870