本文關(guān)鍵詞：動(dòng)脈粥樣硬化中血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)與基因干預(yù)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景目的隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高,動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)相關(guān)性疾病已成為威脅人類(lèi)健康的主要?dú)⑹?AS是一種系統(tǒng)性疾病,病變常同時(shí)累及全身大中動(dòng)脈血管,主要表現(xiàn)為動(dòng)脈管壁脂質(zhì)及纖維基質(zhì)堆積,管腔狹窄。AS也是冠狀動(dòng)脈性心臟病(coronary heart disease, CHD)的主要病理類(lèi)型。AS的病因及確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,現(xiàn)有的研究證實(shí)炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。根據(jù)“損傷-反應(yīng)”和慢性炎癥學(xué)說(shuō),各種AS危險(xiǎn)因素可以導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC)損傷,隨后EC表達(dá)細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecules)增加,如血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1).細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule, ICAM)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(platelet-endothelid cell adhesion molecule-1, PEC AM-1)等,趨化血液?jiǎn)魏思?xì)胞及T淋巴細(xì)胞粘附。單核細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜下啟動(dòng)炎性反應(yīng),分泌一系列細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素(interleukin, IL)、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein, MCP)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)等,這些細(xì)胞因子可進(jìn)一步激活EC、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)及巨噬細(xì)胞,促進(jìn)粥樣斑塊的發(fā)生、發(fā)展。VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族,其分子量為100-1 10KD,配體是分布于白細(xì)胞表面的VLA-4分子。VCAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá),可以促進(jìn)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,加速白細(xì)胞向血管內(nèi)皮下游走,并能促進(jìn)SMC的增殖,因此認(rèn)為VCAM-1在AS中發(fā)揮重要作用,加速了AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞表面的VCAM-1可以脫落進(jìn)入血液形成可溶性VCAM-1 (soluble vascular cell adhesion molecule-1, sVCAM-1)。因?yàn)橹苯訙y(cè)定血管內(nèi)皮組織中的VCAM-1相對(duì)困難,目前國(guó)內(nèi)外研究多通過(guò)測(cè)定血液中的sVCAM-1作為測(cè)定VCAM-1的間接指標(biāo)。Hackmen等研究發(fā)現(xiàn)高TG患者血液中sVCAM-1水平上升。為了進(jìn)一步明確VCAM-1與CAD的關(guān)系,本研究選擇行主動(dòng)脈-冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass graft, CABG)時(shí)廢棄的主動(dòng)脈管壁組織,應(yīng)用免疫組化檢測(cè)VCAM-1表達(dá),探討人體動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)與AS發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。材料方法1.研究對(duì)象(1)對(duì)象：選取2008年12月至2012年2月在山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院行CABG患者36例,其中男性27例,女性9例,年齡為48-78歲,平均63.6±9.2歲。36例CABG患者中合并吸煙者6例,高血壓15例,糖尿病12例。對(duì)照組為12例腎臟移植手術(shù)供體者,均為男性,年齡為34-52歲,平均39.4±4.5歲。入院后經(jīng)查體排除各種明顯器質(zhì)性疾病。(2)標(biāo)本：研究組患者行CABG時(shí)留取廢棄的全層主動(dòng)脈組織,36例CABG取得動(dòng)脈組織56塊。對(duì)照組供體者行腎臟移植手術(shù)時(shí)留取廢棄的腎動(dòng)脈組織,12例腎臟移植取得動(dòng)脈組織46塊。2.生化分析所有研究組患者及對(duì)照組成員均于清晨空腹采靜脈血6m1,于山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室測(cè)定靜脈血漿總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、血清甘油三酯(triglycerides,TG)及脂蛋白(a) [lipoprotein (a), Lp(a)]、載脂蛋白A (apolipoprotein, ApoA)、脂蛋白B (apolipoprotein B, ApoB)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin, IBIL)等生化指標(biāo)。3.冠狀動(dòng)脈造影及冠狀動(dòng)脈Gensini積分測(cè)定所有研究組患者均行冠狀動(dòng)脈造影(coronary angiography, CAG),對(duì)造影結(jié)果進(jìn)行錄像并刻錄光盤(pán),由兩位介入心血管病專(zhuān)家分析圖像。通過(guò)目測(cè)法判定冠狀動(dòng)脈狹窄程度。應(yīng)用冠狀動(dòng)脈Gensini積分方法評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度。4.標(biāo)本采集及免疫組化研究組36例患者行CABG手術(shù)時(shí)留取其打孔廢棄的主動(dòng)脈壁全層組織,對(duì)照組為12例腎移植供體者移植時(shí)修剪廢棄的動(dòng)脈組織。上述組織獲取后,立即儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)備用。兩組動(dòng)脈管壁組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定、梯度酒精脫水、二甲苯脫酒精、石蠟包埋、切片。選擇多聚賴(lài)氨酸進(jìn)行載玻片防脫片處理,切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化,檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù),3%雙氧水消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,加入兔抗人VCAM-1多克隆抗體(1：300),4℃冰箱孵育過(guò)夜,加入酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物,室溫孵育30min, DAB顯色,鏡下控制顯色時(shí)間,蘇木素復(fù)染、分化、返藍(lán)、梯度酒精脫水、二甲苯脫酒精、晾干、中性樹(shù)脂封片。免疫組化染色切片經(jīng)顯微圖像分析系統(tǒng)檢測(cè),每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野,測(cè)定每個(gè)視野中陽(yáng)性信號(hào)的平均光密度值(optical density, OD),取其平均值即為VCAM-1相對(duì)表達(dá)量。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)定數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,計(jì)量資料均數(shù)組間比較采用t檢驗(yàn),兩變量之間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.研究組及對(duì)照組一般情況比較研究組患者36例均行CABG,其中男性27例,女性9例,年齡為46-78歲,平均63.6±9.2歲。36例CABG患者中合并吸煙者6例,高血壓15例,糖尿病12例。對(duì)照組為12例腎臟移植手術(shù)供體者,均為男性,年齡為34-52歲,平均39.4±4.5歲。入院后經(jīng)查體排除各種明顯器質(zhì)性疾病。2.生化指標(biāo)：研究組36例患者血漿TC. LDL-C及Lp(a). ApoB. TG測(cè)定值較正常參考值顯著升高,P0.05；血漿HDL-C及ApoA測(cè)定值與正常參考值相比明顯降低,P0.01；研究組患者血漿TBIL及IBIL測(cè)定值較正常參考值顯著降低,P0.05；血漿DBIL測(cè)定值雖然較正常參考值降低,但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。2.CAG研究組36例患者行CAG結(jié)果顯示冠狀動(dòng)脈均有不同程度的鈣化、狹窄和迂曲,其中LM病變14例,三支病變14例,二支病變合并LAD近端病變8例；合并慢性閉塞病變4例。研究組36例患者冠狀動(dòng)脈Gensini積分為24-128,平均66.64±29.11。3.動(dòng)脈組織中VCAM-1表達(dá)情況研究組36例患者主動(dòng)脈組織免疫組化檢測(cè)均有不同程度的VCAM-1表達(dá),主動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量為0.14-0.400D,平均0.21±0.050D。VCAM-1陽(yáng)性表達(dá)著色主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞漿,表現(xiàn)為棕褐色,染色分布不均勻,呈顆粒狀、片狀、簇狀或條狀。對(duì)照組12例動(dòng)脈組織常規(guī)病理組織學(xué)檢查無(wú)異常,免疫組化檢測(cè)動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量為0.06-0.10OD,平均0.08±0.030D,研究組和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。4.研究組主動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量與AS主要危險(xiǎn)因素的關(guān)系研究組36例患者主動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量男性為0.21±0.040D,女性為0.20±0.070D,男女之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；吸煙者為0.27±0.050D,非吸煙者為0.15±0.040D,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；高血壓患者為0.23±0.060D,非高血壓患者為0.19±0.040D,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；糖尿病患者為0.27±0.080D,非糖尿病患者為0.19±0.020D,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.研究組主動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量與血脂水平相關(guān)性分析研究組36例患者主動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量分別與TG、TC、LDL-C、 HDL-C、Lp(a)、ApoAI、ApoB行線性相關(guān)分析,結(jié)果提示VCAM-1表達(dá)量與TG、TC、LDL-C、Lp(a)、ApoB呈正相關(guān),P0.05。VCAM-1表達(dá)量與HDL-C. ApoA、TBIL、DBIL、IBIL測(cè)定值負(fù)相關(guān),P0.05。6.研究組主動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈Gensini積分相關(guān)性分析研究組36例患者主動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈Gensini積分相關(guān)性分析,結(jié)果提示VCAM-1表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈Gensini積分呈正相關(guān)(r=0.431,P0.05)。結(jié)論1.本研究顯示,研究組36例CAGB患者主動(dòng)脈組織免疫組化檢測(cè)VCAM-1表達(dá)量平均為0.21±0.050D,而對(duì)照組12例腎移植廢棄的動(dòng)脈組織免疫組化檢測(cè)VCAM-1表達(dá)量平均為0.08±0.030D,研究組VCAM-1表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.研究組36例CABG患者冠狀動(dòng)脈造影顯示,其Gensini積分平均為66.64±29.11,與主動(dòng)脈組織免疫組化檢測(cè)VCAM-1的表達(dá)量呈正相關(guān)。3. CABG患者主動(dòng)脈組織中VCAM-1表達(dá)水平與血漿TG, TC、LDL-C、 LP(a)、ApoB呈正相關(guān),與血漿HDL-C、ApoA呈負(fù)相關(guān)。4.本研究組患者有吸煙、高血壓、糖尿病等病史,較沒(méi)有吸煙、高血壓、糖尿病等病史的患者,其主動(dòng)脈組織中VCAM-1表達(dá)量顯著增高。背景：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)相關(guān)性疾病日益成為人類(lèi)健康的最主要威脅,在許多國(guó)家由于AS所導(dǎo)致的心血管疾病已成為首位死亡原因。AS是一種主要累及大動(dòng)脈和中動(dòng)脈的慢性進(jìn)展性疾病,在動(dòng)脈內(nèi)皮下形成斑塊,造成管腔的狹窄和動(dòng)脈內(nèi)血栓形成,最終導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床后果。目前的研究均發(fā)現(xiàn)AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有大量的炎性細(xì)胞的參與并分泌多種炎性介質(zhì),炎癥學(xué)說(shuō)得到大多數(shù)學(xué)者公認(rèn)。血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)在AS的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在動(dòng)脈硬化發(fā)生的早期,白細(xì)胞的粘附、聚集是一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié),正常的血管內(nèi)皮不與白細(xì)胞粘附,但在動(dòng)脈硬化部位白細(xì)胞粘附于內(nèi)膜表面,并穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間連接進(jìn)入到內(nèi)膜。內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的粘附分子參與了白細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜的過(guò)程。VCAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá),可以促進(jìn)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,加速白細(xì)胞向血管內(nèi)皮下游走,并能促進(jìn)SMC的增殖,因此認(rèn)為VCAM-1在AS中發(fā)揮重要作用,加速了AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNA(double stranded, dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象。當(dāng)一段與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)相同的dsRNA被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí),該mRNA就會(huì)發(fā)生降解,造成基因在轉(zhuǎn)錄或翻譯的環(huán)節(jié)發(fā)生阻斷而抑制基因的表達(dá),引起基因沉默。RNAi目前作為一種替代基因敲除的研究工具得到廣泛的應(yīng)用。目前RNAi技術(shù)中常使用的dsRNA載體有兩種,一種是非病毒載體,主要指攜帶dsRNA的質(zhì)粒,其主要的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染率較低。另一種dsRNA載體為病毒載體,其中,慢病毒載體應(yīng)用最為廣泛,其優(yōu)點(diǎn)是基因表達(dá)穩(wěn)定、基因轉(zhuǎn)移高效、免疫原性小、生物安全性高等。慢病毒載體介導(dǎo)的干擾導(dǎo)致的靶基因活性改變最為穩(wěn)定,且最為持久。目的：本研究利用載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)構(gòu)建AS模型,并通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)使ApoE-/-小鼠的VCAM-1基因沉默,觀察VCAM-1在AS進(jìn)展中所起的作用,為AS的治療提供思路。材料方法：1.動(dòng)物模型制備共30支雄性8周齡ApoE-/-小鼠,體重20g-25g,給予高脂飼料飼養(yǎng)。4周后,小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組和基因干預(yù)組,每組15只。對(duì)照組小鼠經(jīng)股靜脈注射空載體慢病毒懸液(1x108 TU/ml,20ul),基因干預(yù)組小鼠經(jīng)股靜脈注射VCAM-1干擾慢病毒懸液(1x108TU/ml,20ul)。注射慢病毒4周后,腹腔注射10%水合氯醛0.1ml將小鼠麻醉,將小鼠四肢固定在鼠板上,用剪刀剪開(kāi)胸前皮膚,并剪斷胸骨,使心臟暴露。經(jīng)右心房穿刺抽取靜脈血1.5m1。用眼科剪將右心耳剪開(kāi)一缺口,用輸液器針頭從心尖處插入約2mm,應(yīng)用無(wú)菌生理鹽水灌流沖洗心腔及主動(dòng)脈血管,直到肝臟及肺臟顏色由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色或白色,停止灌流。小心剝離心臟和全程主動(dòng)脈,于髂動(dòng)脈處將其完整剪下。由升主動(dòng)脈處剪下心臟,剪去心臟心尖部分,于冰凍切片機(jī)內(nèi)包埋于OCT中,包埋好的組織于冰凍切片機(jī)中連續(xù)切片,置于-20℃冰箱中保存。剩余主動(dòng)脈組織置于-20℃冰箱中保存。2.血脂測(cè)定ApoE-/-小鼠麻醉后固定于鼠板上,剪開(kāi)胸腔,經(jīng)右心房采取靜脈血1.5m1,離心分離血清,應(yīng)用生化自動(dòng)分析儀測(cè)定血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、血清甘油三酯(triglycerides, TG)水平。3. Western Blot利用Western Blot方法檢測(cè)對(duì)照組及基因沉默組小鼠主動(dòng)脈組織VCAM-1蛋白表達(dá)水平。4.組織學(xué)分析小鼠主動(dòng)脈根部組織經(jīng)OCT包埋機(jī)包埋后切片。組織切片分別進(jìn)行HE染色、油紅O染色及巨噬細(xì)胞MOMA-2染色。5.數(shù)據(jù)分析利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)值變量用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x士s)來(lái)表示,計(jì)量資料之間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染慢病毒的安全性經(jīng)股靜脈向ApoE-/-小鼠體內(nèi)注射慢病毒懸液或空載體慢病毒懸液后,觀察小鼠進(jìn)食、飲水狀況,未發(fā)現(xiàn)異�，F(xiàn)象,兩組小鼠均未發(fā)生死亡。試驗(yàn)結(jié)束前稱(chēng)重,兩組小鼠間體重并未見(jiàn)明顯差異(P0.05)。2. ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織的VCAM-1蛋白表達(dá)水平Western Blot檢測(cè)ApoE-A小鼠主動(dòng)脈組織中VGAM-1蛋白質(zhì)含量,結(jié)果顯示與對(duì)照組小鼠相比,基因沉默組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中VCAM-1蛋白水平明顯下降(P0.05)。3. VCAM-1基因沉默對(duì)ApoE-/-小鼠血脂的影響處死前取靜脈血檢測(cè)兩組ApoE-/-小鼠血液中的TC、LDL-C、HDL-C及TG水平,結(jié)果表明兩組小鼠間TC、LDL-C、HDL-C及TG水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4. VCAM-1基因沉默對(duì)主動(dòng)脈AS斑塊的影響HE染色顯示,VCAM-1基因沉默組小鼠主動(dòng)脈AS斑塊面積相比對(duì)照組顯著減少(P0.05)。脂質(zhì)油紅O染色顯示,相比對(duì)照組,ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊中的脂質(zhì)含量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。巨噬細(xì)胞MOMA-2染色顯示,VCAM-1基因沉默組小鼠斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量相比對(duì)照組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)可以安全而有效地使ApoE-/-小鼠的VCAM-1基因沉默。2. VCAM-1基因沉默后,ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部AS斑塊體積明顯減小,且斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量明顯減少。3. ApoE-/-小鼠動(dòng)脈AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞減少,可能是VCAM-1基因沉默使AS病變減輕的機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：人類(lèi) 活體 動(dòng)脈粥樣硬化 血管細(xì)胞粘附分子-1 冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù) 免疫組織化學(xué) VCAM-1 基因沉默 RNA干擾 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 第一部分6-74
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符號(hào)說(shuō)明17-20
• 前言20-24
• 材料方法24-33
• 結(jié)果33-36
• 討論36-50
• 結(jié)論50-51
• 創(chuàng)新點(diǎn)局限性51-52
• 附表附圖52-64
• 參考文獻(xiàn)64-74
• 第二部分74-110
• 中文摘要74-78
• 英文摘要78-81
• 前言81-83
• 材料方法83-90
• 結(jié)果90-91
• 討論91-98
• 結(jié)論98-99
• 創(chuàng)新點(diǎn)局限性99-100
• 附表附圖100-104
• 參考文獻(xiàn)104-110
• 致謝110-111
• 在讀期間發(fā)表論文111-112
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表112-114
• SCI文章Ⅰ114-134
• SCI文章Ⅱ134-161

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 朱平,李小鷹,石懷銀,韋立新;心血管病患者尸檢中主動(dòng)脈粥樣硬化與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度的相關(guān)性分析[J];中華心血管病雜志;2004年06期

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  本文關(guān)鍵詞：動(dòng)脈粥樣硬化中血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)與基因干預(yù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：393870