阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病,是當(dāng)代社會中老年人口中最常見的癡呆形式。AD的神經(jīng)病理學(xué)特征包括由淀粉樣蛋白(Aβ)形成的細(xì)胞外斑塊、過度磷酸化微管相關(guān)蛋白(tau)積累形成的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)和廣泛的神經(jīng)元丟失。長久以來,“淀粉樣蛋白級聯(lián)假說”認(rèn)為Aβ肽的異常積累是AD發(fā)病的關(guān)鍵。然而,迄今為止,集中于減少Aβ沉積的Aβ免疫療法均未產(chǎn)生臨床上有意義的結(jié)果。因此,單純通過消除Aβ病理學(xué)不足以達(dá)到治愈AD的效果,而開發(fā)靶向tau病理學(xué)的治療手段也成為了一種非常有潛力的治療策略之一。Tau蛋白是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中的一種主要的微管相關(guān)蛋白(由microtubule-associated protein(MAPT)基因編碼),在生理條件下調(diào)節(jié)微管的組裝和穩(wěn)定性以及軸突運(yùn)輸。然而,在病理生理條件下,在AD和相關(guān)的病理性疾病(包括皮質(zhì)基底變性(CBD),進(jìn)行性核上麻痹(PSP),Pick病(PD)和額顳葉癡呆(FTLD))中,大量毒性表位的tau出現(xiàn)了異常高水平的磷酸化,如Ser...

【文章頁數(shù)】：235 頁

【學(xué)位級別】：博士

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摘要
Abstract
關(guān)鍵詞及縮寫
第一章 前言
    1.1 阿爾茨海默病
        1.1.1 阿爾茨海默病研究發(fā)展進(jìn)程
        1.1.2 阿爾茨海默病的流行病學(xué)
        1.1.3 阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制研究
            1.1.3.1 Aβ 蛋白級聯(lián)假說
            1.1.3.2 Tau蛋白致病假說
    1.2 阿爾茨海默病動物模型研究
        1.2.1 轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物模型
            1.2.1.1 Aβ 病理轉(zhuǎn)基因鼠
            1.2.1.2 Tau病理轉(zhuǎn)基因鼠
        1.2.2 非人靈長類動物模型
    1.3 阿爾茨海默病治療現(xiàn)狀
        1.3.1 阿爾茨海默病治療策略及分類
        1.3.2 以tau為靶點(diǎn)的阿爾茨海默病療法
            1.3.2.1 主動免疫療法
            1.3.2.2 被動免疫療法
            1.3.2.3 微管穩(wěn)定劑類
            1.3.2.4 Tau聚集抑制劑類
            1.3.2.5 調(diào)節(jié)tau磷酸化水平
    1.4 靶向tau的免疫治療方法的機(jī)制
    1.5 諾如病毒P顆粒疫苗載體系統(tǒng)
        1.5.1 諾如病毒
        1.5.2 諾如病毒P顆粒
        1.5.3 基于諾如病毒P顆粒蛋白載體的疫苗研究現(xiàn)狀
    1.6 研究意義與實驗設(shè)計
        1.6.1 研究意義
        1.6.2 實驗思路與設(shè)計
            1.6.2.1 P301S模型小鼠跟蹤部分
            1.6.2.2 AD疫苗部分
第二章 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 菌種、質(zhì)粒載體與細(xì)胞
        2.1.3 多肽合成
        2.1.4 實驗設(shè)備
        2.1.5 實驗試劑與耗材
        2.1.6 溶液配制
            2.1.6.1 鼠尾消化液
            2.1.6.2 TAE緩沖液
            2.1.6.3 PBS
            2.1.6.4 變性電泳緩沖液(SDS-running buffer)
            2.1.6.5 非變性電泳緩沖液(native running buffer)
            2.1.6.6 電轉(zhuǎn)緩沖液
            2.1.6.7 考馬斯亮藍(lán)染色液
            2.1.6.8 脫色液
            2.1.6.9 Basal buffer
            2.1.6.10 10×DNA loading buffer
            2.1.6.11 5×蛋白loading buffer
            2.1.6.12 5×蛋白native loading buffer
            2.1.6.13 戊巴比妥鈉溶液
            2.1.6.14 4%多聚甲醛溶液
            2.1.6.15 分化液
            2.1.6.16 返藍(lán)液
            2.1.6.17 檸檬酸抗原修復(fù)液
            2.1.6.18 TBS與TBST
            2.1.6.19 PMSF母液
            2.1.6.20 Na F母液
            2.1.6.21 釩酸鈉母液
            2.1.6.22 焦磷酸鈉(Na2P2O4)母液
            2.1.6.23 RAB buffer
            2.1.6.24 RIPA buffer
            2.1.6.25 Urea buffer(腦勻漿用)
            2.1.6.26 30%丙烯酰胺溶液
            2.1.6.27 氨芐青霉素溶液
            2.1.6.28 卡那霉素溶液
            2.1.6.29 氯霉素溶液
            2.1.6.30 L-阿拉伯糖溶液
            2.1.6.31 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)
            2.1.6.32 (親和層析)平衡液
            2.1.6.33 (親和層析)咪唑洗脫液
            2.1.6.34 抗原包被液
            2.1.6.35 連接反應(yīng)用碳酸氫銨溶液
            2.1.6.36 R10培養(yǎng)基
            2.1.6.37 ACK(紅細(xì)胞裂解液)
            2.1.6.38 (293T)細(xì)胞復(fù)蘇液
            2.1.6.39 (293T)細(xì)胞培養(yǎng)基
            2.1.6.40 胰酶
    2.2 實驗方法
        2.2.1 動物飼養(yǎng)及動物倫理
        2.2.2 P301S轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定
        2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.4 小鼠行為學(xué)實驗
            2.2.4.1 握力實驗
            2.2.4.2 加速轉(zhuǎn)棒實驗
            2.2.4.3 步幅長度
            2.2.4.4 復(fù)合表型評分系統(tǒng)(肢體協(xié)調(diào)綜合評分)
            2.2.4.5 筑巢實驗
            2.2.4.6 曠場實驗
            2.2.4.7 水迷宮實驗
        2.2.5 動物血漿及組織樣本取材與保存
            2.2.5.1 血漿樣本取材與保存
            2.2.5.2 血清樣本取材與保存
            2.2.5.3 組織樣本取材與保存
        2.2.6 組織切片與染色
            2.2.6.1 石蠟切片的制備
            2.2.6.2 HE染色
            2.2.6.3 甲苯胺藍(lán)染色
            2.2.6.4 免疫組織化學(xué)染色(IHC)
        2.2.7 腦勻漿制備
        2.2.8 蛋白電泳
            2.2.8.1 SDS-PAGE(變性)電泳
            2.2.8.2 Native PAGE(非變性)電泳
        2.2.9 考馬斯亮藍(lán)染色
        2.2.10 免疫印跡實驗
            2.2.10.1 Western blot
            2.2.10.2 Dot blot
        2.2.11 質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.11.1 pCold Ⅳ-PP-3C質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.11.2 pET20b-Tau質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.11.3 pCDNA3.1-YFP /pCDNA3.1-CFP質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.11.4 pCDNA3.1-RD(WT)-(HA)質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.11.5 pCDNA3.1-LM-(HA)/pCDNA3.1-△K-(HA)質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2.11.6 pCDNA3.1-△K-YFP /pCDNA3.1-△K-CFP質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.12 蛋白原核表達(dá)與純化
            2.2.12.1 PP-3C蛋白純化
            2.2.12.2 Tau蛋白的純化
        2.2.13 疫苗制備
            2.2.13.1 多肽疫苗的制備
            2.2.13.2 PP-pTau31疫苗的制備
            2.2.13.3 佐劑使用
        2.2.14 ELISA
            2.2.14.1 血漿/腦勻漿tau含量測定
            2.2.14.2 血清抗體含量測定
            2.2.14.3 血清抗體分型實驗
        2.2.15 硫酸銨沉淀法純化血清蛋白
        2.2.16 ELISPOT
        2.2.17 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.18 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        2.2.19 FRET實驗
        2.2.20 統(tǒng)計學(xué)方法
第三章 實驗結(jié)果與討論:P301S轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)、病理學(xué)及血清學(xué)跟蹤研究
    3.1 行為學(xué)研究
        3.1.1 體重
        3.1.2 生存期
        3.1.3 握力實驗
        3.1.4 加速轉(zhuǎn)棒實驗
        3.1.5 步幅長度
        3.1.6 復(fù)合表型評分系統(tǒng)(肢體協(xié)調(diào)綜合評分)
        3.1.7 水迷宮實驗
        3.1.8 曠場實驗
        3.1.9 筑巢實驗
        3.1.10 小結(jié)
    3.2 病理學(xué)研究
        3.2.1 免疫印跡實驗(western blot)
        3.2.2 免疫組織化學(xué)染色(IHC)
        3.2.3 臟器變化
        3.2.4 小結(jié)
    3.3 血清學(xué)研究
        3.3.1 血漿中人源tau蛋白變化
        3.3.2 血漿炎癥因子和趨化因子變化
        3.3.3 腦勻漿炎癥因子和趨化因子變化
        3.3.4 小結(jié)
    3.4 檢測因子相關(guān)性分析
    3.5 討論
    3.6 結(jié)論
第四章 實驗結(jié)果與討論:以諾如病毒P顆粒為載體的磷酸化tau表位疫苗對AD治療效果和作用機(jī)制研究
    4.1 磷酸化tau表位疫苗磷酸化表位篩選
        4.1.1 候選重組磷酸化tau多肽的設(shè)計
        4.1.2 候選重組磷酸化tau多肽的免疫原性分析
        4.1.3 優(yōu)選重組磷酸化tau多肽表位pTau31的安全性分析
        4.1.4 小結(jié)
    4.2 以諾如病毒P顆粒為載體的pTau31表位疫苗的制備與表征
        4.2.1 PP-pTau31表位疫苗的設(shè)計
        4.2.2 諾如病毒P顆粒蛋白基因突變與構(gòu)建
        4.2.3 重組諾如病毒P顆粒蛋白PP-3C的表達(dá)與純化
        4.2.4 重組諾如病毒P顆粒蛋白PP-3C理化性質(zhì)分析
            4.2.4.1 PP-3C蛋白分子量及聚體形式分析
            4.2.4.2 透射電鏡(TEM)對重組諾如病毒P蛋白形態(tài)分析
        4.2.5 重組諾如病毒P顆粒蛋白與pTau31多肽連接工藝與連接效率研究
        4.2.6 小結(jié)
    4.3 磷酸化tau表位疫苗PP-pTau31的免疫原性與優(yōu)選佐劑研究
        4.3.1 PP-pTau31的免疫原性評價
            4.3.1.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫設(shè)計
            4.3.1.2 PP-pTau31免疫原性評價
        4.3.2 優(yōu)選疫苗佐劑篩選
            4.3.2.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫設(shè)計
            4.3.2.2 免疫原性評價
        4.3.3 PP-pTau31疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)分析
        4.3.4 小結(jié)
    4.4 PP-pTau31疫苗在P301S轉(zhuǎn)基因鼠中的免疫效果研究
        4.4.1 PP-pTau31疫苗在P301S轉(zhuǎn)基因鼠中的免疫方案設(shè)計
        4.4.2 PP-pTau31疫苗在P301S轉(zhuǎn)基因鼠中的免疫原性分析
        4.4.3 P301S轉(zhuǎn)基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后的行為學(xué)變化研究
            4.4.3.1 P301S轉(zhuǎn)基因鼠體重變化
            4.4.3.2 P301S轉(zhuǎn)基因鼠生存期變化
            4.4.3.3 P301S轉(zhuǎn)基因鼠運(yùn)動相關(guān)行為學(xué)變化
            4.4.3.4 P301S轉(zhuǎn)基因鼠認(rèn)知行為學(xué)變化
        4.4.4 P301S轉(zhuǎn)基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后腦中蛋白水平變化研究
            4.4.4.1 P301S轉(zhuǎn)基因鼠腦勻漿中tau蛋白水平變化
            4.4.4.2 P301S轉(zhuǎn)基因鼠腦海馬區(qū)tau蛋白水平變化
            4.4.4.3 P301S轉(zhuǎn)基因鼠腦海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞水平變化
        4.4.5 PP-pTau31疫苗在P301S轉(zhuǎn)基因鼠中治療的安全性分析
            4.4.5.1 PP-pTau31疫苗在P301S轉(zhuǎn)基因鼠中誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)分析
            4.4.5.2 PP-pTau31疫苗免疫后P301S轉(zhuǎn)基因鼠血清中細(xì)胞因子的變化
            4.4.5.3 PP-pTau31疫苗免疫后P301S轉(zhuǎn)基因鼠的腦勻漿細(xì)胞因子變化
            4.4.5.4 PP-pTau31疫苗免疫后P301S轉(zhuǎn)基因鼠的組織病理變化
        4.4.6 小結(jié)
    4.5 PP-pTau31疫苗的免疫作用機(jī)制研究
        4.5.1 免疫治療后P301S轉(zhuǎn)基因鼠血漿tau蛋白水平變化
        4.5.2 免疫治療后P301S轉(zhuǎn)基因鼠腦勻漿tau蛋白傳播活性分析
            4.5.2.1 FRET檢測游離tau蛋白活性方法建立
                4.5.2.1.1 質(zhì)粒構(gòu)建
                4.5.2.1.2 質(zhì)粒表達(dá)驗證
                4.5.2.1.3 FRET檢測方法適用性評估
            4.5.2.3 免疫治療后P301S轉(zhuǎn)基因鼠腦勻漿tau蛋白傳播活性檢測
        4.5.3 PP-pTau31疫苗誘導(dǎo)的抗體性質(zhì)分析
            4.5.3.1 血清抗體結(jié)合NFT效果研究
            4.5.3.2 血清抗體對腦勻漿中tau蛋白傳播活性的抑制效果研究
        4.5.4 小結(jié)
    4.6 討論
    4.7 結(jié)論
展望
參考文獻(xiàn)
作者簡歷及攻讀博士學(xué)位期間科研成果
致謝



本文編號：3937952