脊髓損傷(SCI)和多發(fā)性硬化(MS)等脫髓鞘疾病給患者帶來不同程度的運動障礙,疾病嚴(yán)重時會造成患者半身不遂和完全癱瘓。然而臨床上針對脫髓鞘疾病的治療非常有限。髓鞘遭到破壞后產(chǎn)生的髓鞘碎片是刺激炎癥反應(yīng)和抑制神經(jīng)修復(fù)造成繼發(fā)性損傷的重要因素,因此闡明清理髓鞘碎片的細(xì)胞分子機(jī)制可能會有助于指導(dǎo)脫髓鞘疾病的臨床治療。目前已知骨髓來源的巨噬細(xì)胞是在脊髓損傷中心清理髓鞘碎片的主要細(xì)胞,但它們被募集到損傷中心發(fā)揮作用至少需要一周。是否有其他類型的細(xì)胞能在脫髓鞘區(qū)域及時清理髓鞘碎片還不得而知。因此,本研究旨在探索參與早期髓鞘碎片吞噬的細(xì)胞類型及后續(xù)影響,從而明確該新型吞噬髓鞘碎片的細(xì)胞在脫髓鞘疾病發(fā)展過程的作用和地位。本研究的主要發(fā)現(xiàn)如下:1.小鼠SCI和MS脫髓鞘疾病模型顯示脫髓鞘區(qū)域的微血管內(nèi)皮富集髓鞘碎片和髓鞘碎片降解產(chǎn)物中性脂質(zhì)。體外實驗發(fā)現(xiàn)原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞系以及在基質(zhì)膠上形成的由原代內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的類血管結(jié)構(gòu)均能吞噬髓鞘碎片。內(nèi)皮細(xì)胞吞噬髓鞘碎片不依賴于巨噬細(xì)胞所需的LRP1,CR3和Mac2受體,但依賴于血清IgG對髓鞘碎片的調(diào)理素作用和IgG受體Fc。以上體內(nèi)外結(jié)果表明微血管內(nèi)...

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
主要縮寫詞
1 緒論
    1.1 問題的提出及意義
    1.2 脫髓鞘疾病概述
        1.2.1 髓鞘和脫髓鞘疾病的概念
        1.2.2 脫髓鞘疾病的誘因和分類
        1.2.3 脫髓鞘疾病的臨床癥狀和治療
    1.3 脫髓鞘疾病中幾種重要細(xì)胞類型的行為
        1.3.1 星型膠質(zhì)細(xì)胞在脫髓鞘疾病中的行為
        1.3.2 小膠質(zhì)細(xì)胞在脫髓鞘疾病中的行為
        1.3.3 骨髓來源的巨噬細(xì)胞在脫髓鞘疾病中的行為
    1.4 微血管內(nèi)皮細(xì)胞在脫髓鞘疾病中的行為
        1.4.1 微血管內(nèi)皮的特點和功能
        1.4.2 微血管內(nèi)皮在脫髓鞘疾病中的行為
    1.5 細(xì)胞自噬的概述
        1.5.1 細(xì)胞自噬的概念
        1.5.2 細(xì)胞自噬的分子機(jī)制
        1.5.3 細(xì)胞自噬與疾病的關(guān)系
    1.6 研究內(nèi)容與研究模式圖
    1.7 論文的新穎性
2 體內(nèi)微血管內(nèi)皮和體外微類血管結(jié)構(gòu)吞噬髓鞘碎片的研究
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與試劑
        2.2.1 實驗動物和細(xì)胞
        2.2.2 實驗儀器和器皿
        2.2.3 實驗試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 構(gòu)建體內(nèi)脫髓鞘疾病SCI和 EAE模型用于研究微血管內(nèi)皮吞噬髓鞘碎片的能力.
        2.3.2 構(gòu)建體外類血管結(jié)構(gòu)用于研究微血管內(nèi)皮吞噬髓鞘碎片的能力
        2.3.3 免疫熒光染色和油紅染色
        2.3.4 統(tǒng)計分析
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 在體內(nèi)小鼠SCI和 EAE模型中微血管內(nèi)皮吞噬髓鞘碎片并降解成中性脂質(zhì)
        2.4.2 體外生成的類血管結(jié)構(gòu)中微血管內(nèi)皮吞噬髓鞘碎片
    2.5 討論與小結(jié)
3 體外微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬髓鞘碎片、吞噬效率和機(jī)制的研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與試劑
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗儀器
        3.2.3 實驗試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 微血管內(nèi)皮細(xì)胞與髓鞘碎片共培養(yǎng)檢測體外吞噬及吞噬效率
        3.3.2 微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬髓鞘碎片的機(jī)制
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬髓鞘碎片的時間依賴性
        3.4.2 微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬髓鞘碎片依賴于Ig G的調(diào)理素作用
    3.5 討論與小結(jié)
4 微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬髓鞘碎片的轉(zhuǎn)錄組研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與試劑
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗儀器
        4.2.3 實驗試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 吞噬髓鞘碎片的血管內(nèi)皮細(xì)胞的RNA測序
        4.3.2 實時熒光定量PCR驗證RNA測序結(jié)果
    4.4 實驗結(jié)果
    4.5 討論和小結(jié)
5 微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬髓鞘碎片的細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制研究
    5.1 引言
    5.2 材料、儀器與試劑
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 實驗儀器
        5.2.3 實驗試劑
    5.3 實驗方法
        5.3.1 免疫熒光檢測髓鞘碎片在胞內(nèi)移動和定位
        5.3.2 蛋白免疫印跡驗證髓鞘碎片激活細(xì)胞自噬途徑
        5.3.3 利用CRISPR-Cas9 技術(shù)建立ATG5 敲除的BMECs系[90]
        5.3.4 利用油紅染色研究細(xì)胞自噬對髓鞘碎片的傳遞作用
    5.4 實驗結(jié)果
        5.4.1 髓鞘碎片在細(xì)胞內(nèi)溶酶體中降解
        5.4.2 髓鞘碎片在細(xì)胞內(nèi)通過細(xì)胞自噬途徑到達(dá)溶酶體
        5.4.3 利用CRISPR-Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建Atg5 敲除的細(xì)胞系
        5.4.4 通過Atg5 敲除的細(xì)胞系證明細(xì)胞自噬對髓鞘碎片到達(dá)溶酶體是必須的
    5.5 討論與小結(jié)
6 微血管內(nèi)皮吞噬髓鞘碎片的功能變化之血管新生
    6.1 引言
    6.2 材料、儀器和試劑
        6.2.1 實驗材料
        6.2.2 實驗儀器
        6.2.3 實驗試劑
    6.3 實驗方法
        6.3.1 免疫熒光檢測髓鞘碎片在SCI和 EAE疾病模型中對血管新生的影響
        6.3.2 免疫熒光和細(xì)胞計數(shù)檢測髓鞘碎片對體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響
        6.3.3 小鼠皮下移植內(nèi)皮細(xì)胞檢測基質(zhì)膠血管新生
        6.3.4 利用Atg5 敲除的細(xì)胞系和q-PCR技術(shù)研究促血管增殖的機(jī)理
    6.4 實驗結(jié)果
        6.4.1 髓鞘碎片在SCI和EAE疾病模型中促進(jìn)血管新生
        6.4.2 髓鞘碎片與BMECs共培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞增殖
        6.4.3 小鼠皮下移植和脊髓顯微注射吞噬了髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管新生
        6.4.4 髓鞘碎片通過細(xì)胞自噬在細(xì)胞內(nèi)傳遞進(jìn)而促進(jìn)VEGF表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖
    6.5 討論與小結(jié)
7 微血管內(nèi)皮吞噬髓鞘碎片的功能變化之炎癥反應(yīng)
    7.1 引言
    7.2 材料、儀器和試劑
        7.2.1 實驗材料
        7.2.2 實驗儀器
        7.2.3 實驗試劑
    7.3 實驗方法
        7.3.1 免疫熒光檢測髓鞘碎片在GFP嵌合小鼠SCI和 EAE疾病模型中的炎癥反應(yīng)
        7.3.2 細(xì)胞顯微注射到脊髓研究吞噬髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)
        7.3.3 通過BMDMf黏附和蛋白免疫印跡實驗檢測髓鞘碎片對體外內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的影響
        7.3.4 q-PCR,BMDMf遷移和ELISA檢測吞噬髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞上清的炎癥因子
    7.4 實驗結(jié)果
        7.4.1 髓鞘碎片在GFP嵌合小鼠SCI模型和EAE疾病模型中促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)
        7.4.2 吞噬髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞注射到脊髓引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)
        7.4.3 吞噬髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥粘附因子表達(dá)上調(diào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的粘附
        7.4.4 吞噬髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子到上清液中刺激BMDMf的趨藥性
    7.5 討論與小結(jié)
8 微血管內(nèi)皮吞噬髓鞘碎片的功能變化之纖維化
    8.1 引言
    8.2 材料、儀器和試劑
        8.2.1 實驗材料
        8.2.2 實驗儀器
        8.2.3 實驗試劑
    8.3 實驗方法
        8.3.1 免疫熒光檢測SCI和 EAE疾病模型中內(nèi)皮的膠原和纖連蛋白的表達(dá)
        8.3.2 免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測吞噬髓鞘碎片內(nèi)皮細(xì)胞膠原和纖連蛋白的表達(dá)
        8.3.3 基質(zhì)膠2D膠類血管結(jié)構(gòu)實驗檢測體外類血管結(jié)構(gòu)膠原蛋白的表達(dá)
    8.4 實驗結(jié)果
        8.4.1 體內(nèi)SCI和 EAE疾病模型中內(nèi)皮的膠原和纖連蛋白的表達(dá)明顯增加
        8.4.2 吞噬髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞膠原和纖連蛋白的表達(dá)明顯增加
    8.5 討論與小結(jié)
9 微血管內(nèi)皮吞噬髓鞘碎片的功能變化之內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化
    9.1 引言
    9.2 材料、儀器和試劑
        9.2.1 實驗材料
        9.2.2 實驗儀器
        9.2.3 實驗試劑
    9.3 實驗方法
        9.3.1 免疫熒光檢測SCI和 EAE疾病模型中內(nèi)皮的α-SMA蛋白的表達(dá)
        9.3.2 顯微鏡白光觀察細(xì)胞形態(tài)變化,免疫熒光檢測內(nèi)皮細(xì)胞α-SMA蛋白的表達(dá)
        9.3.3 q-PCR和蛋白免疫印跡檢測內(nèi)皮細(xì)胞α-SMA核酸和蛋白水平的表達(dá)
    9.4 實驗結(jié)果
        9.4.1 吞噬髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化,并且α-SMA的表達(dá)明顯增加
        9.4.2 吞噬髓鞘碎片的內(nèi)皮細(xì)胞α-SMA核酸和蛋白水平的表達(dá)明顯增加
        9.4.3 在SCI和 EAE疾病模型中內(nèi)皮的α-SMA蛋白的表達(dá)明顯增加
    9.5 討論與小結(jié)
10 結(jié)論與展望
    10.1 全文的主要結(jié)論
    10.2 后續(xù)工作建議
參考文獻(xiàn)
附錄
    A 作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文
    B 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號：3935872