乳腺癌是全球女性發(fā)病率、死亡率第一的癌癥,在癌癥治療中一直被高度關(guān)注。新發(fā)現(xiàn)的癌癥-睪丸抗原BAP31分子,是一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶蛋白,它能夠參與很多生物過程,但它在乳腺癌中的功能尚未被深入研究。在本研究中,我們在大量臨床病例樣本中觀察到,乳腺癌組織樣本相對于正常組織樣本和癌旁組織樣本的BAP31基因異常高表達,并且高表達BAP31基因的病人總體預(yù)后更差,無遠端轉(zhuǎn)移生存率更差。而且BAP31基因的高表達與腫瘤更高的分級、更高的惡性程度都具有一定的正相關(guān)性。因此我們決定在乳腺癌細胞系和小鼠模型中深入探究BAP31基因的功能以及作用機制。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)BAP31基因能夠廣泛影響乳腺癌細胞的表型,BAP31基因的敲低能夠抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和凋亡抵抗。我們通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀、銀染和質(zhì)譜的方法,找到了與BAP31分子相結(jié)合的蛋白SERCA2。后者是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的主要負責將鈣離子逆濃度梯度運輸進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的鈣離子泵,它和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜上的其他鈣離子泵和通道共同維持細胞的鈣離子穩(wěn)態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)BAP31與SERCA2的直接結(jié)合并不影響各自的蛋白水平,但是BAP31基因的敲低能夠使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 癌癥概述
        1.1.1 癌癥的現(xiàn)狀
        1.1.2 癌癥的生物學特性
        1.1.3 癌癥的診斷與治療
    1.2 乳腺癌概述
        1.2.1 乳腺癌的誘因和預(yù)防
        1.2.2 乳腺癌的分期和分類
        1.2.3 乳腺癌的診斷和治療
    1.3 細胞凋亡與腫瘤轉(zhuǎn)移
        1.3.1 原位腫瘤的轉(zhuǎn)移過程
        1.3.2 細胞凋亡及失巢凋亡
    1.4 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與鈣離子穩(wěn)態(tài)
        1.4.1 鈣離子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
        1.4.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子泵SERCA2
        1.4.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶BAP31
第2章 實驗結(jié)果與討論
    2.1 BAP31在乳腺癌中高表達并與不良預(yù)后相關(guān)
        2.1.1 BAP31在乳腺癌中高表達
        2.1.2 BAP31在乳腺癌中與不良預(yù)后相關(guān)
        2.1.3 BAP31在乳腺癌細胞系中高表達
    2.2 BAP31與SERCA2相互作用
        2.2.1 BAP31與SERCA2分子直接結(jié)合
        2.2.2 BAP31影響SERCA2轉(zhuǎn)運鈣離子功能
        2.2.3 BAP31與SERCA2分子協(xié)同維持細胞ER穩(wěn)態(tài)
    2.3 BAP31在乳腺癌細胞惡性表型中的作用
        2.3.1 BAP31影響乳腺癌細胞增殖
        2.3.2 BAP31影響乳腺癌細胞克隆形成、非錨定生長能力
        2.3.3 BAP31影響乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲
        2.3.4 BAP31影響乳腺癌細胞凋亡和失巢凋亡
    2.4 SERCA2在乳腺癌細胞惡性表型中的作用
        2.4.1 SERCA2影響乳腺癌細胞增殖
        2.4.2 SERCA2影響乳腺癌細胞克隆形成、非錨定生長能力
        2.4.3 SERCA2影響乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲
        2.4.4 SERCA2影響乳腺癌細胞凋亡和失巢凋亡
    2.5 BAP31通過SERCA2促進乳腺癌細胞增殖轉(zhuǎn)移
    2.6 BAP31在體內(nèi)維持乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移
        2.6.1 BAP31影響乳腺癌原位腫瘤生長
        2.6.2 BAP31影響乳腺癌原位組織浸潤和遠端轉(zhuǎn)移能力
    2.7 結(jié)果與討論
第3章 材料與方法
    3.1 臨床組織樣本的收集分析
    3.2 細胞培養(yǎng)
    3.3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建
        3.3.1 BAP31和SERCA2過表達載體的構(gòu)建
        3.3.2 BAP31和SERCA2敲低載體的構(gòu)建
        3.3.3 帶Flag標簽的BAP31截短蛋白載體構(gòu)建
    3.4 慢病毒的包裝和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的建立
    3.5 細胞和組織總RNA的抽提和檢測
        3.5.1 病理樣本的總RNA抽提
        3.5.2 細胞的總RNA抽提
        3.5.3 cDNA的合成和實時熒光定量PCR
    3.6 細胞總蛋白的提取和檢測
    3.7 細胞功能檢測實驗
        3.7.1 細胞活力和克隆形成能力測定
        3.7.2 細胞周期的檢測
        3.7.3 細胞凋亡和失巢凋亡的檢測
        3.7.4 細胞軟瓊脂非錨定生長能力檢測
        3.7.5 細胞基質(zhì)膠培養(yǎng)實驗
        3.7.6 細胞遷移和侵襲能力檢測
        3.7.7 細胞劃痕愈合能力檢測
        3.7.8 細胞分散實驗
    3.8 蛋白質(zhì)免疫沉淀實驗
    3.9 銀染實驗
    3.10 免疫熒光實驗
    3.11 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子外流的檢測
    3.12 腫瘤切片的免疫組織化學染色
    3.13 小鼠原位脂肪墊荷瘤實驗
    3.14 尾靜脈小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移實驗
    3.15 生物信息學分析及統(tǒng)計
參考文獻
附錄A 實驗試劑
附錄B 主要實驗儀器設(shè)備
附錄C 實驗室常規(guī)試劑溶液配制
附錄D 常規(guī)實驗方法
    細胞DNA抽提
    Trizol法抽提RNA
    去除RNA中的DNA殘留
    逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)
    實時定量PCR
    PCR片段擴增
    PCR產(chǎn)物及凝膠回收
    酶切反應(yīng)
    連接反應(yīng)
    感受態(tài)細胞的制備
    細菌轉(zhuǎn)化
    質(zhì)粒小量抽提
    質(zhì)粒中量抽提
    蛋白濃度測定
    Western Blot
    蛋白抽提
    MTT細胞活力測定
    細胞計數(shù)實驗
    細胞貼壁培養(yǎng)克隆形成實驗
    碘化丙啶(PI)法檢測細胞周期
    Transwell遷移和侵襲實驗
    劃痕愈合實驗
    細胞克隆分散實驗
    Annexin V/PI雙染色流式檢測細胞凋亡實驗
    免疫熒光技術(shù)
    免疫組織化學染色
    組織切片TUNEL實驗
附錄E 引物序列和抗體信息
致謝
在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文與取得的研究成果



本文編號：3926774