流感病毒感染可誘發(fā)急性肺損傷(ALI)與其介導的大量I型干擾素(IFN-I)產(chǎn)生關系密切。干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)是負責IFN-I產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子家族,包括IRF1-9。盡管IRF3和IRF7被普遍認為是調(diào)控IFN-I產(chǎn)生的主要轉(zhuǎn)錄因子,IRF家族所有成員都能識別/結合其靶基因啟動子上富含GAAA序列元件的特征提示可能都對流感病毒感染應答。本文以流感病人鼻咽上皮細胞和流感模型小鼠肺組織作為局部應答組織、流感模型小鼠外周血白細胞及其他組織如心、腸、肝、腎、脾、胃作為全身應答組織,觀察了IRF家族成員對流感病毒應答的表達譜變化,并用專職產(chǎn)生IFN-I的人p DC樣CAL-1細胞研究了流感病毒誘導IRF家族表達譜的變化規(guī)律及可能調(diào)控機制。本研究為流感病毒誘發(fā)急性免疫損傷如ALI的診斷和防治提供了分子靶標。

【文章頁數(shù)】：158 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
提要
中文摘要
abstract
英文縮略詞表
第一篇 文獻綜述
    (一)流感病毒感染與其相關免疫應答
        1.1 流感病毒簡介
        1.2 流感病毒與固有免疫
        1.3 干擾素及其信號轉(zhuǎn)導途徑
        1.4 Ⅰ型干擾素與炎癥反應
    (二)干擾素調(diào)節(jié)因子家族成員及其免疫調(diào)節(jié)作用
        2.1 IRF家族成員的結構特征
        2.2 IRF家族成員的生物學功能
        2.3 IRF3、IRF5和IRF7是TLR及 RLR信號傳導中Ⅰ型 IFN表達的主要調(diào)控因子
    (三)寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)的研究進展
        3.1 免疫刺激性寡脫氧核苷酸的結構特征與功能
        3.2 免疫抑制性寡脫氧核苷酸的結構特征與功能
    課題設計思路
第二篇 研究內(nèi)容
    第一章 流感病毒感染后對局部和全身IRF家族成員表達水平的影響
        前言
        第一節(jié) 流感病毒感染人局部組織中IRFs的表達水平變化
            1 材料與方法
                1.1 研究對象
                    1.1.1 患者鼻咽拭子標本采集
                    1.1.2 鼻咽拭子標本的病毒檢測和分類
                    1.1.3 IAV、IBV和非呼吸道感染者臨床指標采集
                1.2 實驗試劑與器材
                1.3 實驗方法
                    1.3.1 IAV、IBV和非呼吸道感染患者鼻咽拭子標本的收集及研究流程圖
                    1.3.2 鼻咽拭子標本的處理和病毒檢測
                    1.3.3 Trizol法提取IAV、IBV和非呼吸道感染者鼻咽上皮細胞內(nèi)總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
                    1.3.4 RT-qPCR法檢測流感病毒感染患者鼻咽拭子標本中IRF家族成員的m RNA表達水平
                1.4 統(tǒng)計分析
            2 實驗結果
                2.1 不同流感病毒感染的鼻咽上皮細胞分類
                2.2 IAV、IBV和非呼吸道感染患者臨床資料分析
                2.3 流感病毒感染患者鼻咽上皮細胞中IRF家族成員的m RNA水平檢測
            3 討論
            4 小結
        第二節(jié) 流感病毒感染小鼠局部和全身組織中IRFs的表達水平變化及GAAA ODN對其的調(diào)節(jié)作用
            1 材料與方法
                1.1 實驗動物和細胞
                1.2 流感病毒
                1.3 寡脫氧核苷酸
                1.4 實驗試劑與器材
                1.5 實驗方法
                    1.5.1 流感病毒的擴增和血凝效價的測定
                    1.5.2 流感病毒在MDCK細胞上半數(shù)組織細胞感染劑量(TCID50)的檢測
                    1.5.3 流感病毒感染小鼠LD50的檢測
                    1.5.4 流感病毒感染小鼠模型的建立
                    1.5.5 流感病毒感染小鼠肺及其他重要臟器組織中IRF家族m RNA水平的檢測
                    1.5.6 流感病毒感染小鼠經(jīng)GAAA ODN M1 干預處理后,小鼠肺及其他重要臟器組織中IRF家族m RNA水平的檢測
                1.6 統(tǒng)計分析
            2 實驗結果
                2.1 H1N1流感病毒的擴增和血凝效價的測定
                2.2 H1N1流感病毒在MDCK細胞上半數(shù)組織細胞感染劑量的測定
                2.3 流感病毒感染BALB/c小鼠的LD50測定
                2.4 H1N1感染小鼠肺等臟器中IRF家族的m RNA表達譜及GAAA ODN M1對IRFs表達的調(diào)控作用
            3 討論
            4 小結
    第二章 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞后對IRFs,TLR3/7,RIG-Ⅰ及其下游信號分子表達的影響
        前言
        第一節(jié) 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞IRF-IFN-Ⅰ信號通路相關因子的表達
            1 材料與方法
                1.1 細胞
                1.2 流感病毒
                1.3 實驗試劑與器材
                1.4 實驗方法
                    1.4.1 流感病毒H1N1 感染不同時間對人pDC樣 CAL-1 細胞IRF家族表達譜的影響
                    1.4.2 流感病毒H9N2 感染不同時間對人pDC樣 CAL-1 細胞IRF家族表達譜的影響
                    1.4.3 流感病毒H1N1 感染不同時間對IRFs上游PRR受體信號通路(TLR3、TLR7、RIG-Ⅰ)和下游IFN-Ⅰ及炎癥因子表達影響
                    1.4.4 分別用人重組干擾素(rIFN-α2b)和重組rIFN-γ處理CAL-1 細胞對IRFs及ISGs表達的影響
                    1.4.5 統(tǒng)計分析
            2 實驗結果
                2.1 流感病毒H1N1 感染對人pDC樣 CAL-1 細胞IRF家族表達譜的影響
                2.2 流感病毒H9N2 感染不同時間對人pDC樣 CAL-1 細胞IRF家族表達譜的影響
                2.3 流感病毒H1N1 感染不同時間對IRFs上游PRR受體信號通路(TLR3、TLR7、RIG-Ⅰ)和下游IFN-Ⅰ及炎癥因子表達影響
                2.4 分別用人重組干擾素(rIFN-α2b)和重組rIFN-γ處理CAL-1 細胞對IRFs及 ISGs表達的影響
            3 討論
            4 小結
        第二節(jié) 流感病毒對CAL-1 細胞IRF家族及其上下游信號分子表達調(diào)控的可能機制探討
            1 材料與方法
                1.1 細胞
                1.2 流感病毒
                1.3 寡脫氧核苷酸
                1.4 實驗試劑與器材
                1.5 實驗方法
                    1.5.1 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞用人重組干擾素(rIFN-α2b)處理對IRF家族表達水平的影響
                    1.5.2 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞用人重組干擾素(rIFN-α2b)處理對TLR3/7及其下游信號分子表達水平的影響
                    1.5.3 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞同時用不同濃度的氯喹處理對IRF家族表達水平的影響
                    1.5.4 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞同時用不同濃度的氯喹處理對TLR3/7 及其下游信號分子表達水平的影響
                    1.5.5 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞同時用不同濃度的GAAA ODN A1 處理對IRF家族表達水平的影響
                    1.5.6 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞同時用不同濃度的GAAA ODN A1 處理對TLR3/7及其下游信號分子表達水平的影響
                    1.5.7 統(tǒng)計分析
            2 實驗結果
                2.1 重組rIFN-α2b,氯喹和GAAA ODN A1對H1N1感染的CAL-1 細胞中IRF家族表達譜的影響
                2.2 重組IFN-α2b,氯喹和GAAA ODN A1對H1N1感染的CAL-1 細胞中TLR3/7 及其下游信號分子表達的影響
            3 討論
            4 小結
        第三節(jié) 流感病毒感染CAL-1 細胞后對IRF3、IRF5和IRF7 磷酸化水平的影響
            1 材料與方法
                1.1 細胞
                1.2 流感病毒
                1.3 寡脫氧核苷酸
                1.4 實驗試劑與器材
                1.5 實驗方法
                    1.5.1 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 及用GAAA ODN A1 處理對IRF3,IRF5,IRF7 的表達和磷酸化水平的影響
                    1.5.2 GAAA ODN A1對H1N1感染CAL-1細胞中IRF5核轉(zhuǎn)位的影響
                    1.5.3 統(tǒng)計分析
            2 實驗結果
                2.1 流感病毒感染人pDC樣 CAL-1 細胞及用GAAA ODN A1 處理對IRF3,IRF5,IRF7 的表達和磷酸化水平的影響
                2.2 GAAA ODN A1對H1N1感染CAL-1細胞中IRF5核轉(zhuǎn)位的影響
            3 討論
            4 小結
    第三章 不同單鏈RNA病毒對人pDC樣 CAL-1 細胞中IRFs、TLR3/7和RIG-Ⅰ及其下游信號分子表達的影響
        前言
        1 材料與方法
            1.1 細胞
            1.2 不同ssRNA病毒
            1.3 實驗試劑與器材
            1.4 實驗方法
                1.4.1 不同流感病毒感染CAL-1 細胞中TLR3、7和RIG-Ⅰ及其下游信號分子m RNA水平動態(tài)變化
                1.4.2 不同ssRNA病毒對IRF家族表達譜的影響
                1.4.3 統(tǒng)計分析
        2 實驗結果
            2.1 不同流感病毒感染CAL-1 細胞中TLR3、7和RIG-Ⅰ及其下游信號分子mRNA水平動態(tài)變化
            2.2 TNF-和 IFN-m RNA表達水平有可能是決定流感病毒致病性強弱和炎癥強弱的重要指標
            2.3 不同ssRNA病毒對IRF家族表達譜的影響
        3 討論
        4 小結
結論
創(chuàng)新點
參考文獻
作者簡介及在學期間所取得的科研成果
致謝
附錄



本文編號：3919153