背景:大腦皮層是大腦的重要組成部分,參與軀體運動調(diào)節(jié)、情感和意識的形成等。大腦皮層發(fā)育的異常會導致一系列發(fā)育性疾病的產(chǎn)生,比如小頭癥、無腦回綜合癥等。神經(jīng)干細胞是大腦中所有細胞的來源,它的正常增殖、分化及分化后的正常遷移是保證大腦皮層正常發(fā)育的關鍵因素,而轉錄因子在調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的一系列細胞生物學行為中起到關鍵的作用。本文的主要研究對象是轉錄因子Zeb1,是典型的螺旋-環(huán)-螺旋型轉錄因子,該類型的轉錄因子在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及損傷修復中起到重要的作用。目的:目前對大腦皮層發(fā)育分子調(diào)節(jié)機制的了解還十分有限,本實驗旨在探索Zeb1在大腦皮層發(fā)育過程中所起到的作用及機制。方法:(1)通過蛋白免疫印跡和免疫熒光在體內(nèi)和體外檢測Zeb1在大腦皮層發(fā)育過程中表達的時間和細胞定位。(2)利用Zeb1敲除小鼠檢測Zeb1敲除后對大腦皮層分層發(fā)育的影響,對放射狀膠質細胞增殖、分化、分裂軸角度的影響,對體外分離的神經(jīng)放射狀膠質細胞分裂模式的影響。(3)用胚胎子宮電轉(IUE)的方法檢測干擾Zeb1后對皮層神經(jīng)元遷移的影響。(4)用基因芯片篩查加熒光定量PCR驗證的方法篩查Zeb1的下游調(diào)控基因。通過熒光報告素...

【文章頁數(shù)】：126 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 神經(jīng)系統(tǒng)及大腦皮層發(fā)育的開端
    1.2 神經(jīng)干細胞的增殖分化與遷移
    1.3 大腦皮層發(fā)育過程中轉錄因子的協(xié)作
    1.4 信號通路在大腦皮層發(fā)育過程中的作用
        1.4.1 Sonic hedgehog通路
        1.4.2 Wnt信號通路
        1.4.3 Notch信號通路
    1.5 上皮與間質轉化以及關鍵轉錄因子Zeb1
    1.6 PRMT5
    1.7 Pak3(p21-activated kinases)
第二章 轉錄因子Zeb1 對小鼠大腦皮層的發(fā)育的影響
    2.1 引言
    2.2 實驗動物和儀器
        2.2.1 實驗動物
        2.2.2 儀器設備
    2.3 實驗材料與方法
        2.3.1 免疫印跡與免疫熒光
        2.3.2 冰凍切片樣品的準備
        2.3.3 免疫熒光
        2.3.4 神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)
    2.4 實驗結果
        2.4.1 Zeb1 在胚胎不同發(fā)育階段的大腦皮層中的表達譜
        2.4.2 Zeb1 在胚胎發(fā)育階段的大腦皮層中的定位
    2.5 小結與討論
第三章 敲除Zeb1 基因對大腦皮層發(fā)育的影響
    3.1 引言
    3.2 實驗動物和儀器
        3.2.1 實驗動物
        3.2.2 實驗儀器
    3.3 實驗材料與方法
        3.3.1 大腦皮層分層免疫熒光染色
    3.4 實驗結果
    3.5 小結與討論
第四章 敲除Zeb1 抑制神經(jīng)干細胞增殖并促進其分化
    4.1 引言
    4.2 實驗動物和儀器
        4.2.1 實驗動物
        4.2.2 實驗儀器
    4.3 實驗材料與方法
        4.3.1 免疫熒光
        4.3.2 實驗方法
        4.3.3 細胞周期退出檢測
        4.3.4 單細胞分裂檢測
    4.4 實驗結果
        4.4.1 敲除Zeb1 導致干細胞增殖能力下降
        4.4.2 敲除Zeb1 抑制放射狀膠質細胞的增殖,促進其分化
        4.4.3 Zeb1 敲除促使神經(jīng)干細胞退出細胞周期
        4.4.4 敲除Zeb1 促進神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的不對稱分裂
    4.5 小結與討論
第五章 敲除Zeb1 促進了過早成熟的神經(jīng)元的遷移
    5.1 前言
    5.2 實驗動物和儀器
        5.2.1 實驗動物
        5.2.2 儀器設備
    5.3 實驗材料與方法
        5.3.1 干擾質粒的構建
        5.3.2 細胞的培養(yǎng)與干擾質粒的轉染
        5.3.3 熒光定量PCR驗證
        5.3.4 胚胎子宮電轉(IUE)
    5.4 實驗結果
        5.4.1 干擾Zeb1 促進表層神經(jīng)元遷移
    5.5 小結與討論
第六章 Zeb1 調(diào)控皮層神經(jīng)元遷移機制的研究
    6.1 前言
    6.2 實驗動物和儀器
        6.2.1 實驗動物的和細胞
        6.2.2 實驗儀器
    6.3 實驗材料與方法
        6.3.1 取材及基因型鑒定
        6.3.2 干細胞的培養(yǎng)
        6.3.3 干細胞RNA的提取
        6.3.4 組織RNA的提取
        6.3.5 基因芯片
        6.3.6 反轉錄與熒光定量PCR
        6.3.7 Zeb1 基因的克隆
        6.3.8 啟動子區(qū)的克隆
        6.3.9 雙熒光報告素酶基因檢測
        6.3.10 染色質免疫共沉淀(ChIP)
        6.3.11 免疫共沉淀
        6.3.12 考馬斯亮藍染色及質譜鑒定
        6.3.13 細胞的免疫熒光
        6.3.14 胚胎子宮電轉(IUE)
    6.4 實驗結果
        6.4.1 芯片結果及qPCR結果驗證
        6.4.2 熒光報告素酶基因驗證
        6.4.3 過表達Pak3 促進神經(jīng)元的遷移
        6.4.4 Zeb1與PRMT5 共同調(diào)控Pak3 基因的轉錄
        6.4.5 Zeb1與PRMT5 共定位
        6.4.6 PRMT5 輔助Zeb1 抑制Pak3 的轉錄
    6.5 小結與討論
第七章 Zeb1 募集PRMT5 調(diào)控神經(jīng)元遷移的功能研究
    7.1 前言
    7.2 實驗動物和儀器
        7.2.1 實驗動物
        7.2.2 實驗儀器
    7.3 實驗方法
        7.3.1 胚胎子宮電轉(IUE)
        7.3.2 Pak3 干擾質粒的構建
        7.3.3 干擾質粒的驗證
        7.3.4 N2A細胞的轉染及RNA的提取
        7.3.5 熒光定量PCR
        7.3.6 Pak3 抗干擾同義突變質粒的構建
    7.4 實驗結果
    7.5 小結與討論
全文總結與討論
展望
參考文獻
致謝
攻讀博士學位期間以單獨第一作者發(fā)表或錄用的論文



本文編號：3914214