本文關(guān)鍵詞：靶向TGF-βⅡ型受體的適配子殼聚糖緩釋凝膠對大鼠濾過術(shù)后結(jié)膜瘢痕的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:目前抗青光眼手術(shù)是青光眼降眼壓治療的主要治療方式,而濾過通道結(jié)膜瘢痕是手術(shù)失敗的主要原因,因此通過抑制結(jié)膜瘢痕化以提高抗青光眼手術(shù)的成功率仍是眼科研究的重要方向之一。目前臨床上廣泛應(yīng)用絲裂霉素C(MMC)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)降低青光眼術(shù)后瘢痕化,提高濾過術(shù)成功率,但仍然存在某些并發(fā)癥,包括愈合延遲、術(shù)后淺前房、濾過泡滲漏及角膜毒性等,嚴(yán)重影響手術(shù)效果1,2。臨床上尚缺乏有效的、毒副作用小的藥物以減少瘢痕形成,延長濾過泡生存時間。研究報道轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在結(jié)膜瘢痕形成過程中起重要作用,并且在青光眼房水中發(fā)現(xiàn)其含量增加3-5。抗纖維化治療的一個重要方向就是靶向配體或者受體作用,特異性阻斷TGF-β作用,可減弱結(jié)膜組織的纖維化4,6,7。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要通過與細(xì)胞膜上的受體(transforming growth factor-βreceptor,TβR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用,TGF-β首先與TβR II結(jié)合再與TβR I形成TGF-β-TβR II-TβR I復(fù)合體,TβR II磷酸化TβR I的GS區(qū),啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)8-11。TGF-β與TβR II的結(jié)合是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開始的始動因素,通過靶向TβR II以抑制配體與受體相結(jié)合達(dá)到減弱其生物學(xué)效應(yīng)的作用。本課題組前期應(yīng)用SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)篩選得到靶向TβR II胞外段的特異核酸適配子,是一類功能與抗體類似的新型分子,具有親和力高、組織穿透能力強(qiáng)等特點12。在人Tenon囊成纖維細(xì)胞(HTFs)上進(jìn)一步篩選和驗證了適配子S58可通過靶向結(jié)合TβR II從而抑制TGF-β的作用,結(jié)果顯示適配子S58可抑制TGF-β2誘導(dǎo)的HTFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化13。為了延長核酸適配子的作用時間,更好地應(yīng)用于體內(nèi)實驗,我們使用殼聚糖(chitosan,CS)納米微粒包裹適配子S58(CS/S58),延長其作用時間14。殼聚糖溫敏型水凝膠作為一種新型的可用于可注射、非靜脈的給藥方式,具有優(yōu)異的控釋、緩釋、靶向性,可將藥物直接送達(dá)病原部位,選擇性地釋放藥物,既可以保護(hù)藥物不被酶解,又使藥物在靶區(qū)達(dá)到所需的藥物濃度,提高療效減少藥物的毒副作用;此外,殼聚糖無毒,且有良好的生物相容性和降解性15-19。研究表明殼聚糖可抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖20,21,因此本研究制備了殼聚糖溫敏型水凝膠包被適配子S58,觀察其對結(jié)膜瘢痕化過程的作用。目的:本研究擬在細(xì)胞實驗進(jìn)一步篩選具有阻抑作用的適配子,并將篩選的適配子S58應(yīng)用殼聚糖凝膠包被,以增加適配子作用時間,減少酶類的降解,進(jìn)一步探討殼聚糖/適配子S58溫敏緩釋凝膠(CS/S58)在大鼠濾過術(shù)模型中的抗瘢痕形成的作用。方法:1.通過原代培養(yǎng)人Tenon囊成纖維細(xì)胞(human Tenon fibroblast,HTF),觀察TGF-β2誘導(dǎo)HTF轉(zhuǎn)分化的作用,檢測核酸適配子對TGF-β2作用的干擾效應(yīng),Western blot及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測α-SMA、p Smad2的表達(dá)情況,進(jìn)一步篩選具有阻抑作用的核酸適配子;2.制備殼聚糖溫敏型凝膠,應(yīng)用該凝膠包被核酸適配子,在體外檢測凝膠的包被率及適配子的緩釋效應(yīng);3.構(gòu)建大鼠青光眼濾過術(shù)(glaucoma filtration surgery,GFS)模型,分別用TGF-β2、MMC、殼聚糖凝膠(CS)和CS/S58凝膠處理球結(jié)膜瓣,應(yīng)用裂隙燈及AS-OCT觀察濾過泡的形態(tài)及存活時間,監(jiān)測眼壓變化,狼紅染色觀察手術(shù)區(qū)膠原纖維的沉積;Western blot及組織免疫化學(xué)染色檢測手術(shù)區(qū)結(jié)膜組織表達(dá)Collagen I、α-SMA情況,檢測組織的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖與凋亡情況。結(jié)果:1.TGF-β2誘導(dǎo)HTF表達(dá)α-SMA,并且2 ng/ml、5 ng/ml濃度組作用達(dá)高峰,2ng/ml與5 ng/ml TGF-β2組α-SMA表達(dá)差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);TGF-可促進(jìn)HTF骨架蛋白F-actin及p Smad2的表達(dá),并顯著增強(qiáng)HTF的收縮力。2.適配子S58(20 n M)可阻抑TGF-β2(2 ng/ml)誘導(dǎo)HTF表達(dá)α-SMA、F-actin的作用,減弱Smad2磷酸化水平以及p Smad2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位;并抑制TGF-β2介導(dǎo)HTF細(xì)胞收縮;適配子S68對TGF-β2誘導(dǎo)HTF的作用無明顯影響。3.建立殼聚糖/β-甘油磷酸鈉(CS/β-GP)溫敏型凝膠系統(tǒng),CS/β-GP溶液于37℃水浴2~3 min可由液體轉(zhuǎn)變?yōu)樗z,摩爾比為1:2.6包被適配子S58,包被率達(dá)到88.4±7.2%,體外可持續(xù)緩釋,1mo的持續(xù)緩釋率為84±6.0%。4.采用微管植入法構(gòu)建大鼠GFS模型,濾過泡生存比率=術(shù)后28 d/術(shù)后3 d濾過泡面積×100%,每組至少有8只大鼠,Control組濾過泡生存比率為17±7%,TGF-β組為15±5%,MMC組為30±7%,CS組為28±8%,CS/S58組為36±9%;TGF-β、MMC、CS及CS/S58組與對照組相比的平均眼壓比例分別為95±14%、103±12%、84±21%、78±18%、72±20%。5.GFS術(shù)后1 w TGF-β2(2 ng/ml)組手術(shù)區(qū)球結(jié)膜可見大量炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)胞大量增殖,結(jié)膜組織下致密的膠原纖維沉積,Col I、α-SMA表達(dá)明顯增加;MMC(0.4 mg/ml)處理的球結(jié)膜區(qū)細(xì)胞數(shù)量稀少,組織疏松,細(xì)胞凋亡較多,結(jié)膜上皮下仍可見較多膠原纖維沉積。6.CS凝膠組GFS術(shù)后1 w結(jié)膜下仍可見未吸收的殼聚糖,殼聚糖周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤,以及部分凋亡的細(xì)胞,與對照組相比較,CS凝膠未加重結(jié)膜組織的膠原沉積,Col I表達(dá)反而降低;與CS組比較,CS/S58凝膠組炎性細(xì)胞浸潤較少,膠原纖維沉積減少,Col I、α-SMA表達(dá)均明顯減少。結(jié)論:1.在體外細(xì)胞實驗,靶向TβRII的核酸適配子S58可阻抑TGF-β2誘導(dǎo)HTF向MF轉(zhuǎn)分化,并阻抑p Smad2的表達(dá)以及其胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位,提示適配子S58可干擾TGF-β與其受體相結(jié)合,減弱TGF-β的生物學(xué)作用;2.TGF-β2可加重濾過泡的炎癥反應(yīng),引起細(xì)胞大量增殖,導(dǎo)致手術(shù)區(qū)結(jié)膜組織下致密膠原纖維沉積,濾過泡生存時間明顯縮短,進(jìn)一步明確TGF-β2促進(jìn)結(jié)膜瘢痕形成的機(jī)制;MMC可能通過抑制組織細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡而延長濾過泡的生存時間;3.殼聚糖溫敏凝膠可有效的包被適配子S58,體外持續(xù)緩釋長達(dá)1 mo,累積緩釋率達(dá)84%;CS/S58凝膠可抑制大鼠濾過術(shù)后結(jié)膜組織炎性反應(yīng),顯著抑制Col I、α-SMA表達(dá)以及膠原纖維沉積,濾過泡生存時間顯著延長,提示CS凝膠聯(lián)合適配子S58對結(jié)膜瘢痕的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于單獨CS凝膠的作用,有望為青光眼術(shù)后抗瘢痕治療提供新的思路和方法。
【關(guān)鍵詞】：適配子 轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β) 青光眼濾過術(shù)(GFS) 殼聚糖 水凝膠
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R779.6
【目錄】：

• 英文縮寫詞一覽表5-8
• 英文摘要8-13
• 中文摘要13-16
• 第一章 前言16-19
• 第二章 靶向TGF-β II型受體的核酸適配子S58阻抑TGF-β2 誘導(dǎo)Tenon’s囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化19-36
• 2.1 材料及設(shè)備19-22
• 2.2 實驗內(nèi)容及方法22-26
• 2.3 結(jié)果26-33
• 2.4 討論33-36
• 第三章 殼聚糖/核酸適配子S58溫敏型緩釋凝膠制備及檢測36-45
• 3.1 材料及設(shè)備36-37
• 3.2 實驗內(nèi)容及方法37-39
• 3.3 結(jié)果39-42
• 3.4 討論42-45
• 第四章 大鼠濾過術(shù)模型的構(gòu)建與殼聚糖/S58緩釋凝膠對濾過泡瘢痕形成的抑制作用45-73
• 4.1 大鼠濾過術(shù)后結(jié)膜濾泡形態(tài)及存活的狀態(tài)監(jiān)測實驗內(nèi)容及方法45-54
• 4.1.1 材料與設(shè)備45-48
• 4.1.2 結(jié)果48-51
• 4.1.3 討論51-54
• 4.2 殼聚糖/核酸適配子S58溫敏型緩釋凝膠抑制大鼠濾過術(shù)后結(jié)膜膠原沉積 .54-73
• 4.2.1 實驗內(nèi)容及方法54-60
• 4.2.2 結(jié)果60-69
• 4.2.3 討論69-73
• 全文結(jié)論73-74
• 本研究的創(chuàng)新之處74-75
• 參考文獻(xiàn)75-92
• 文獻(xiàn)綜述 青光眼濾過術(shù)后抗結(jié)膜瘢痕形成的研究進(jìn)展92-116
• 參考文獻(xiàn)101-116
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文116-117
• 致謝117

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李駿,龐琳;抗青光眼濾過術(shù)中應(yīng)用5-氟尿嘧啶和絲裂霉素C對淚膜的影響[J];中華眼科雜志;2001年01期

  本文關(guān)鍵詞：靶向TGF-βⅡ型受體的適配子殼聚糖緩釋凝膠對大鼠濾過術(shù)后結(jié)膜瘢痕的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：389438