本文關(guān)鍵詞：用代謝組學(xué)方法研究DNA甲基化對花生四烯酸代謝的影響及血管內(nèi)皮激活的機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血管內(nèi)皮作為多種血管疾病或危險因子作用的靶器官,在血管疾病的病情進(jìn)展中發(fā)揮著無可比擬的作用。因血管內(nèi)皮細(xì)胞具有活躍的內(nèi)分泌及代謝功能,所以在維持血液的正常流動、調(diào)控管壁的張力、參與管壁的炎癥與修復(fù)等過程中發(fā)揮重要的作用。紊亂的內(nèi)皮功能是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ),而且血管內(nèi)皮功能障礙是導(dǎo)致全身脈管系統(tǒng)動脈粥樣硬化的血管損傷的早期階段表現(xiàn)。因此,血管內(nèi)皮的功能研究對于脈管系統(tǒng)疾病的預(yù)防及治療具有重要意義。本實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn)花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的CYP450通路代謝酶—可溶性表氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase)通過調(diào)控表氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)和二羥-二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs)在內(nèi)皮細(xì)胞中含量而影響內(nèi)皮細(xì)胞功能。同時,編碼可溶性表氧化物水解酶的基因EXPH2受DNA去甲基化調(diào)控,影響sEH的表達(dá)水平及EETs/DHETs的比例,進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮功能失調(diào)。因此,探究AA的代謝平衡對內(nèi)皮細(xì)胞功能具有深遠(yuǎn)的意義。近年來,在探討心血管疾病的病因診斷及防治過程中,表觀遺傳學(xué)扮演著至關(guān)重要的作用,但表觀遺傳尤其是DNA甲基化對AA代謝的影響目前鮮有報道。本課題研究目的是探索DNA甲基化對AA代謝通路間平衡的影響,并進(jìn)一步闡釋在低甲基化狀態(tài)下相關(guān)代謝產(chǎn)物發(fā)揮的重要作用,以期進(jìn)一步為相關(guān)疾病的研究和治療提供新的思路。首先我們使用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)檢測經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-deoxycytidine(5-AZA)處理過的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)內(nèi)的AA代謝產(chǎn)物的變化。通過檢測細(xì)胞內(nèi)AA的COX,LOX及CYP450三大代謝通路中的酶促代謝產(chǎn)物。該代謝組學(xué)方法可以定量檢測30余種AA的代謝產(chǎn)物。我們發(fā)現(xiàn):AA代謝途徑中COX通路代謝酶對甲基化調(diào)控更敏感;處理組細(xì)胞內(nèi)容物AA代謝譜明顯改變,表現(xiàn)為COX通路代謝產(chǎn)物含量增加,尤其是前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)和血栓烷素(thromboxane B2,TXB2)顯著增加。通過Methyl primer express軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)與其它兩條代謝通路相比,COX通路的代謝酶普遍含有更豐富的CpG島,受DNA甲基化調(diào)控的潛力更大�；诖松镄畔W(xué)分析結(jié)果,通過q PCR驗證發(fā)現(xiàn)多個COX通路中的代謝酶的基因表達(dá)顯著升高。在HepG2和HEK293T細(xì)胞中驗證的結(jié)果與信息學(xué)分析預(yù)測吻合,我們推測DNA甲基化調(diào)控AA代謝酶的表達(dá)存在普遍性。進(jìn)一步,DNA甲基化特異性分析實(shí)驗證實(shí)前列腺素D合酶(PTGDS)和血栓素合酶1(TBXAS1)的基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)發(fā)生改變。細(xì)胞功能研究發(fā)現(xiàn),5-AZA可以明顯增加血管粘附因子(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)及細(xì)胞附分子(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因表達(dá)水平,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的激活。COX通路抑制劑預(yù)處理可以顯著降低COX通路代謝產(chǎn)物,同時抑制VCAM-1和ICAM-1的表達(dá),提示內(nèi)皮細(xì)胞的激活被抑制。以代謝組學(xué)手段分析5-AZA處理的小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組的血漿,肝臟和腎臟的代謝譜結(jié)果類似,即:COX通路代謝產(chǎn)物顯著升高,與體外實(shí)驗的AA代謝譜改變一致。同時,經(jīng)q PCR檢測我們發(fā)現(xiàn)主動脈及肝臟中PTGDS和TBXAS1基因表達(dá)水平也被上調(diào)。綜上所述,我們得出以下結(jié)論:1)DNA甲基化可以調(diào)控AA代謝通路中某些關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平;2)DNA甲基化在AA代謝平衡中具有重要作用,而且COX通路對于DNA甲基化的調(diào)控更敏感;3)PTGDS和TBXAS1因DNA甲基化處理更加敏感,從而在AA代謝平衡的紊亂中發(fā)揮重要影響;4)代謝產(chǎn)物前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)和血栓烷素(thromboxane B2,TXB2)參與5-AZA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化�？傊�,DNA甲基化通過調(diào)控AA代謝途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)水平,增加相應(yīng)代謝產(chǎn)物的濃度,進(jìn)而造成AA代謝平衡的紊亂,內(nèi)皮細(xì)胞的功能失調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：DNA甲基化 AA 代謝組學(xué) 內(nèi)皮細(xì)胞 前列腺素
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語11-13
• 前言13-19
• 研究現(xiàn)狀、成果13-18
• 研究目的、方法18-19
• 一、DNA甲基化引起內(nèi)皮細(xì)胞AA代謝失衡19-43
• 1.1 對象和方法19-34
• 1.1.1 主要試劑19-20
• 1.1.2 主要儀器20-22
• 1.1.3 主要試劑的配制22-25
• 1.1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理25-30
• 1.1.5 細(xì)胞內(nèi)容物的代謝產(chǎn)物檢測30-31
• 1.1.6 細(xì)胞內(nèi)基因?qū)崟r定量PCR分析31-34
• 1.1.7 DNA甲基化特異型分析實(shí)驗34
• 1.1.8 統(tǒng)計分析34
• 1.2 結(jié)果34-41
• 1.2.1 5-AZA誘導(dǎo)的DNA去甲基化影響AA代謝通路間平衡34-38
• 1.2.2 5-AZA調(diào)控AA代謝酶的基因表達(dá)水平38-39
• 1.2.3 5-AZA影響AA代謝酶的表達(dá)不是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的39-41
• 1.3 討論41-42
• 1.3.1 代謝組學(xué)研究AA代謝的意義41
• 1.3.2 DNA甲基化對AA代謝酶的作用41-42
• 1.3.3 AA代謝產(chǎn)物對血管的影響42
• 1.4 小結(jié)42-43
• 二、DNA甲基化特異性分析驗證甲基化狀態(tài)改變43-54
• 2.1 對象和方法43-50
• 2.1.1 主要儀器43
• 2.1.2 主要試劑43-44
• 2.1.3 主要試劑配制44-46
• 2.1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理46-47
• 2.1.5 DNA的甲基化特異性PCR分析47-49
• 2.1.6 相關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗49-50
• 2.1.7 統(tǒng)計分析50
• 2.2 結(jié)果50-53
• 2.2.1 生物學(xué)分析TBXAS1的啟動子區(qū)CpG島的含量50-51
• 2.2.2 BSP驗證TBXAS1的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)改變51-52
• 2.2.3 生物學(xué)分析PTGDS的啟動子區(qū)CpG島的含量52-53
• 2.2.4 BSP驗證PTGDS的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)改變53
• 2.3 討論53
• 2.4 小結(jié)53-54
• 三、DNA去甲基化誘導(dǎo)AA代謝紊亂的病理意義54-65
• 3.1 對象和方法54-60
• 3.1.1 主要儀器54
• 3.1.2 主要試劑54-55
• 3.1.3 主要試劑配制55-58
• 3.1.4 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與處理58
• 3.1.5 細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的萃取58
• 3.1.6 實(shí)時定量PCR分析58
• 3.1.7 蛋白電泳與蛋白質(zhì)印記58-60
• 3.1.8 統(tǒng)計分析60
• 3.2 結(jié)果60-63
• 3.2.1 DNA去甲基化誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的激活60-62
• 3.2.2 高同型半胱氨酸 (HCY) 模型中AA代謝譜的改變62-63
• 3.3 討論63-64
• 3.4 小結(jié)64-65
• 四、在體驗證DNA甲基化對AA代謝影響65-72
• 4.1 對象和方法65-69
• 4.1.1 主要儀器65
• 4.1.2 主要試劑65
• 4.1.3 主要試劑配制65
• 4.1.4 動物的飼養(yǎng)與處理65-66
• 4.1.5 血漿及組織內(nèi)代謝產(chǎn)物的萃取66-67
• 4.1.6 實(shí)時定量PCR分析67-69
• 4.1.7 統(tǒng)計分析69
• 4.2 結(jié)果69-71
• 4.2.1 血漿及肝臟內(nèi)AA代謝產(chǎn)物的檢測69-70
• 4.2.2 在體檢測組織內(nèi)靶基因的表達(dá)水平70-71
• 4.3 討論71
• 4.4 小結(jié)71-72
• 全文討論72-75
• 全文結(jié)論75-76
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)76-77
• 參考文獻(xiàn)77-89
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明89-91
• 綜述91-106
• 綜述參考文獻(xiàn)98-106
• 致謝106-107

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 席銳;鄒琛;陳楨s

本文編號：387960