阿福豆苷通過抑制LIMK1活性發(fā)揮對前列腺癌LNCaP、PC-3細胞增殖和凋亡的影響

發(fā)布時間：2017-05-23 10:12

本文關鍵詞：阿福豆苷通過抑制LIMK1活性發(fā)揮對前列腺癌LNCaP、PC-3細胞增殖和凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織的一種惡性腫瘤,基因突變導致前列腺腺泡細胞增殖不受控制是其發(fā)病的主要原因。在2002年,全世界共新發(fā)前列腺癌病例679,000例,占全部新發(fā)腫瘤病例數(shù)的11.7%,在常見腫瘤中位列第5位,在男性腫瘤中位列第2位。但是前列腺癌的發(fā)病率存在顯著的種族和地區(qū)差異,且與年齡呈正相關。在經(jīng)濟發(fā)達的國家,其前列腺癌新發(fā)病例占腫瘤新發(fā)病例的19%,而在發(fā)展中國家前列腺癌新發(fā)病例僅占5.3%。在中國,前列腺癌發(fā)病率相對較低,2002年中國前列腺癌的標化發(fā)病率為1.6/10萬,美國的標化發(fā)病率為124.8/10萬,遠低于美國。然而近年來在我國,隨著老年化進程的加快,以及腫瘤普查力度的加強和程序的完善,前列腺癌發(fā)病率和死亡率也呈逐年增高的趨勢。在上海地區(qū)增長尤為顯著,2000年上海地區(qū)前列腺癌發(fā)病率為12.6/1O萬,而到2006年就已上升到18.8/1O萬。因前列腺癌無特異性的臨床癥狀,且病情隱匿發(fā)展,早期易被誤診為男性前列腺增生癥,臨床確診時常為晚期。對于大多數(shù)的前列腺癌來說,其發(fā)展比較緩慢,但相當一部分分化比較差之前列腺癌,其細胞活躍生長,迅速進展,很快出現(xiàn)局部的侵襲和浸潤,進一步發(fā)展會出現(xiàn)遠處的轉移,特別是骨髓和淋巴結,并擴散到全身的各個臟器,最終將導致患者死亡。盡管內(nèi)分泌治療對于大多數(shù)前列腺癌來說具有一定的療效,能誘使腫瘤細胞發(fā)生凋亡,并使腫瘤的發(fā)展得到有效控制。但其作用僅僅是暫時性的而非一勞永逸的根治性的治療措施。內(nèi)分泌治療前列腺癌大多會隨著時間推移出現(xiàn)生化進展,由對內(nèi)分泌治療敏感變?yōu)椴幻舾?發(fā)展成為激素難治性前列腺癌(hormone refractory prostate cancer, HRPC)或激素非依賴性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer, AIPC)。在前列腺癌內(nèi)分泌治療大約12～18個月后將會出現(xiàn)腫瘤的復發(fā),最終不可避免地發(fā)展成前列腺癌細胞激素治療抵抗。對于激素難治性前列腺癌患者目前主要給予放、化療。但目前所使用的化療藥物價格昂貴且毒副作用很大。由于個體化差異及毒副作用的原因,放、化療治療效果往往不理想。目前已經(jīng)證實傳統(tǒng)的化療和放療并不能使晚期前列腺癌患者生存率有明顯提高,其大多數(shù)的治療作用也僅僅是緩解癥狀。因此從藥用植物這一主要資源提取有效成分,明確其抗癌機制及藥理作用,從而篩選低毒、經(jīng)濟的抗前列腺癌制劑以遏制前列腺癌(尤其是激素非依賴性前列腺癌)患病率的上升趨勢顯得尤為迫切。阿福豆苷(Afzelin)是一種在香睡蓮中發(fā)現(xiàn)的黃酮醇糖苷,它可以通過促進細胞凋亡來抑制乳腺癌細胞的生長,同時可在RAW264.7細胞中清除超氧陰離子自由基。肌動蛋白細胞骨架在所有真核細胞中發(fā)揮著重要的生物學功能,如參與細胞框架的構成,驅使細胞運動及分裂。腫瘤細胞轉移包括肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)重組以及通過細胞外基質(zhì)重構使細胞穿過組織邊界,經(jīng)血液及淋巴管向遠處區(qū)域傳播等多個過程。因此調(diào)控肌動蛋白對癌癥治療具有重大意義。Rho GTpase家族的成員如強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶相關Cdc42結合蛋白激酶α抗體(MRCKa)是肌動蛋白細胞骨架的關鍵調(diào)節(jié)因子,并同多種靶蛋白精密調(diào)控細胞生長及分化。當細胞發(fā)生基因組改變或癌變時,真核細胞更容易發(fā)生不受控制的快速增殖,而這已經(jīng)在前列腺癌細胞中得到證實,其機制為由MRCKα、ROCK1及ROCK2激活的LIMK1激酶水平的提高。研究發(fā)現(xiàn)ROCK的抑制劑在體外可以降低腫瘤細胞的侵襲能力,而在體內(nèi)實驗中可以阻止癌細胞的轉移,包括黑色素瘤、纖維肉瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌。這些生化實體抑制劑被認為可以幫助細胞重建正常的增殖功能并且為癌癥治療提供關鍵的解決方案�；诖�,本實驗目的為觀察阿福豆苷的體外抗前列腺癌活性及其對前列腺癌相關激酶的影響。目的觀察Afzelin的體外抗前列腺癌活性及其對前列腺癌相關激酶的影響。方法(1)細胞培養(yǎng)：雄激素依賴性LNCaP細胞和雄激素非依賴性PC-3細胞系從美國菌種保藏中心(弗吉尼亞州,馬納薩斯)獲得。并據(jù)其建議將LNCaP細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清,谷氨酰胺,2%青霉素-鏈霉素和0.2%慶大霉素的EMEM培養(yǎng)基中。PC-3細胞生長于含2 mM左旋谷酰胺、1.5 g/L碳酸氫鈉(90%)+10%胎牛血清的Ham's F12K培養(yǎng)基中。細胞在37℃含95%空氣和5%二氧化碳濕潤環(huán)境中培養(yǎng)。(2)細胞增殖實驗：將對數(shù)生長期的LNCaP和PC-3細胞,接種于96孔培養(yǎng)板(5000個/孔),每孔100 u1。恒溫箱培養(yǎng)24 h,使細胞貼壁。次日分別加入不同終濃度(0.1,1,10 ug/ml)的阿福豆苷。每組設4個平行孔。在CO2培養(yǎng)箱中再孵育,干預24 h,48 h,72 h后終止培養(yǎng),0 ug/ml組僅加等量培養(yǎng)液。加入10 ul· WST-1標記溶液(WST-1細胞增殖試驗試劑盒；羅氏診斷,印第安納波利斯)后再放置培養(yǎng)箱中孵育2 h。根據(jù)廠家提供的說明書,用96孔板酶標比色計檢測各孔420 nm處的吸光度值(17)。(3)細胞周期分析：將培養(yǎng)的LNCaP和PC-3前列腺癌細胞分別加入不同的濃度的阿福豆苷孵育24 h。粘附細胞用胰蛋白酶消化并與懸浮細胞群混合,然后離心,零度PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌3次,將一部分被洗滌的細胞染成臺盼藍以檢測細胞活性。調(diào)整細胞數(shù)至1x106細胞/ml,以2：1的比例(v/v)在冷甲醇固定過夜,碘化丙啶染色。使用Becton Dickinson (San Jose, CA)流式細胞儀檢測細胞周期分布,分析各個實驗條件下的細胞數(shù)不少于10,000個。使用CellQuest細胞周期分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。(4)蛋白印跡分析：檢測不同濃度(0.1,1及10 μg/ml)阿福豆苷對前列腺癌LNCaP和PC-3細胞中MRCKα, LIMK1及ROCK1激酶表達的影響。采用改良Lowry分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度(DC Protein Assay; Bioroad, Hercules,CA)。分解產(chǎn)物在7～10%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。我們將分解后蛋白轉輸至硝化纖維,用5%脫脂牛奶或3%BSA(牛血清白蛋白)封口,以1xPBS緩沖至0.1%到20%之間。MRCKα, LIMK1及ROCK1的單克隆抗體在Cell Signaling Technology (Beverly, MA)處購買,此抗體已經(jīng)由制造商按照Western blotting的需求進行了適度稀釋。結果(1)阿福豆苷可以降低前列腺癌細胞在體外的生長速率：此項研究分析了阿福豆苷對于PC3和LNCaP這兩種前列腺癌細胞系生長的影響。在這兩種前列腺癌細胞經(jīng)過培養(yǎng)之后,細胞被暴露在濃度逐漸增大的阿福豆苷中(分別為0.1,1和10μg/ml),并通過WST-1細胞增值試驗記錄了之后72小時內(nèi)細胞的發(fā)育能力。圖2的A和B分別顯示了在這72小時之內(nèi),兩種前列腺癌細胞的生長速率。此外,圖中也以百分比的形式顯示出當天的劑量反應曲線,各測量值一式四份。從圖上可以看出,濃度為1 μg/ml與10 μg/ml的阿福豆苷在所有的三個時間點上都強烈影響到了兩種細胞的生長速率,而0.1 μg/ml濃度下沒有明顯的生長抑制作用。阿福豆苷對PC3和LNCaP這兩種類型的細胞都表現(xiàn)出了強有力的生長抑制作用。(2)阿福豆苷誘導PC3和LNCaP細胞凋亡：流式細胞儀分析檢測LNCaP和PC-3細胞在不使用以及使用阿福豆苷24小時后的細胞周期分布。從圖3A可以看出,經(jīng)過濃度為10μg/ml的阿福豆苷處理后的PC-3細胞中,有相當于細胞總數(shù)27.6%的一段寬峰數(shù)值出現(xiàn)在GO期,相比之下的對照組中數(shù)值僅為12.7%。除此之外,有43.3%的細胞達到了生長周期的G1期。這提高了停留在GO期的PC-3細胞數(shù)量。有意思的是,在LNCaP細胞中觀察到了相同的結果,對照組中細胞總數(shù)的12.0%都停止在了GO期,而經(jīng)過濃度為10μg/ml阿福豆苷處理的LNCaP細胞則有19.4%停止在GO期(圖3B),此處也有50.7%的細胞達到了G1期。經(jīng)過阿福豆苷處理后的細胞峰值停留在GO期,說明細胞正在進入大規(guī)模凋亡階段或者毒性反應階段。此項結果也表明,阿福豆苷對這兩種細胞都有選擇性作用。(3)阿福豆苷抑制三磷酸酶家族蛋白質(zhì)的表達：為了觀察阿福豆苷對前列腺癌細胞類型的分子影響,我們對阿福豆苷如何影響細胞周期進程和凋亡過程中某些關鍵分子的表達進行了重點分析。逐漸增加的阿福豆苷濃度會對三磷酸酶家族表達造成影響,如LIMK1, MRCKa和ROCK1蛋白。通過蛋白印記分析發(fā)現(xiàn),當阿福豆苷的劑量增大時,LNCaP與PC-3細胞中的這些激酶的磷酸化逐漸消失(圖4A)。但是通過密度測量之后顯示在PC-3細胞中其抑制作用更加明顯。這些激酶的磷酸化將打亂肌動蛋白細胞骨架,導致細胞快速惡性增長。結論阿福豆苷能強有力的抑制雄激素敏感性LNCaP細胞和雄激素非依賴性PC-3細胞這兩種細胞的增殖,阻斷細胞周期在GO期,誘導LNCaP和PC3細胞凋亡。其對這些細胞的抗癌活性與LIMK1表達抑制有關,當阿福豆苷的劑量增大時,LNCaP與PC-3細胞中的LIMK1, MRCKα和ROCK1蛋白等激酶的磷酸化逐漸消失,這也就證實了阿福豆苷反向調(diào)節(jié)LIMK1的作用是通過抑制MRCKα和ROCK1的方式來達到的,而這些激酶的磷酸化將打亂肌動蛋白細胞骨架,導致細胞快速惡性增長。阿福豆苷抗前列腺癌的體外試驗結果顯示,阿福豆苷能作為一種強有力的治療前列腺癌的方法,應用前景令人鼓舞,然而,還需要進一步的動物實驗來證實其抗癌潛力。創(chuàng)新及意義(1)首次研究證實了阿福豆苷這一從香睡蓮中發(fā)現(xiàn)的黃酮醇糖苷可以降低前列腺癌PC3和LNCaP細胞在體外的生長速率。(2)首次研究證實了阿福豆苷可以提高停留在G0期的LNCaP細胞和PC-3細胞數(shù)量,從而促進前列腺癌PC3和LNCaP細胞凋亡。(3) 首次研究證實了阿福豆苷能抑制前列腺癌PC3和LNCaP細胞中三磷酸酶家族蛋白質(zhì)的磷酸化,抑制前列腺癌PC3和LNCaP細胞快速惡性增長。(4)本研究系統(tǒng)證明了阿福豆苷這一從香睡蓮中提取的黃酮醇糖苷是一種對激素非依賴性前列腺癌治療有效及有前途的抗癌藥物,為激素非依賴性前列腺癌的治療提供了新的方向。
【關鍵詞】：前列腺癌 阿福豆苷 LNCaP細胞 PC-3細胞 GO LIMK1
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
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