本文關(guān)鍵詞：NOK在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率逐年升高,然而目前仍然缺乏有效的防治手段。蛋白酪氨酸激酶已經(jīng)被證明在肺癌的發(fā)病中扮演著重要角色,酪氨酸激酶抑制劑也在肺癌的治療中取得了肯定的療效。NOK是一種新的蛋白酪氨酸激酶,目前的研究發(fā)現(xiàn)其在急性白血病、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中表達(dá),可能是一種新的候選癌基因。然而,NOK在肺癌發(fā)病中的作用尚缺乏充分的臨床證據(jù)支持,其通過何種機(jī)制參與肺癌發(fā)病、受何種信號(hào)通路調(diào)節(jié)也不甚清楚。為此,本實(shí)驗(yàn)從臨床研究,細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究三個(gè)方面探索NOK在肺癌發(fā)病中的作用及機(jī)制,以期為肺癌的發(fā)病機(jī)制和靶向治療研究提供新的思路。方法:1.隨機(jī)入組2007年至2010年在第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科行手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者191例并進(jìn)行隨訪,有以下條件之一者予以排除:接受術(shù)前化療者;接受術(shù)前放療者;接受TKIs等靶向藥物治療者。病人信息的采集包含以下要素:年齡、性別、吸煙史、臨床癥狀、手術(shù)方式、腫瘤大小、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、術(shù)后病理結(jié)果。收集上述患者術(shù)中切除的腫瘤組織標(biāo)本并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,ROC檢驗(yàn)確立陽性標(biāo)準(zhǔn),χ2-test法分析NOK蛋白表達(dá)與各臨床要素的相關(guān)性,Kaplan-Meier法繪制生存曲線,log-rank test法分析NOK蛋白表達(dá)與患者生存時(shí)間之間的關(guān)系;Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型法分析生存時(shí)間和臨床要素之間的單因素和多因素相關(guān)性。2.利用電穿孔法在肺癌A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NOK全長(zhǎng)質(zhì)粒,設(shè)計(jì)干涉NOK基因表達(dá)的RNAi片段并用慢病毒包裝后感染肺癌H520細(xì)胞,分別構(gòu)建穩(wěn)定過/低表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)分析NOK過/低表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分析NOK過/低表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。3.運(yùn)用q RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NOK過/低表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin基因表達(dá)的影響;運(yùn)用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NOK過/低表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響4.運(yùn)用10-9M的雌二醇刺激肺癌H520和Calu-1細(xì)胞,用q RT-PCR方法分別檢測(cè)在雌二醇刺激0h/2h/12h/24h后肺癌細(xì)胞中NOK基因的表達(dá)情況;運(yùn)用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在雌二醇刺激0h/12h后肺癌細(xì)胞中NOK蛋白的表達(dá)情況。利用生物信息學(xué)分析NOK啟動(dòng)子區(qū),尋找潛在的ERE結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果:1.NOK蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在收集的191例肺癌組織標(biāo)本中,NOK蛋白在腫瘤組織中的陽性率為75.4%(144/191),在癌旁組織中的陽性率為14.1%(27/191)。NOK的表達(dá)在腫瘤的不同病理分級(jí)(P=0.035)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.005)、p TNM分期(P=0.020)及Ki-67指數(shù)(P=0.000)分組中具有顯著的組間差異性;在不同性別(P=0.371)、年齡(P=0.470)、吸煙史(P=0.618)、組織學(xué)類型(P=0.332)及p T分期(P=0.525)分組中未見明顯差異性。NOK蛋白表達(dá)陽性的144例肺癌患者中位生存時(shí)間為38月(95%confidence interval[CI]=26-50月),平均生存時(shí)間為34月(95%CI=30-39月);NOK蛋白陰性表達(dá)的47例肺癌患者平均生存時(shí)間為48月(95%CI=43-54月),中位生存時(shí)間無法求得,log-rank test統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示NOK蛋白的表達(dá)對(duì)肺癌患者的生存情況有顯著影響(P=0.004),NOK蛋白陽性表達(dá)的肺癌患者生存時(shí)間縮短。在鱗癌患者中,NOK蛋白陽性表達(dá)的肺癌患者較NOK蛋白陰性表達(dá)的患者生存時(shí)間更短(P=0.022)。在腺癌患者中,NOK蛋白陽性表達(dá)的肺癌患者與NOK蛋白陰性表達(dá)的患者生存時(shí)間之間無明顯差異(P=0.054)。在p TNM I/II期肺癌患者中,NOK蛋白陰性表達(dá)的患者生存時(shí)間與陽性表達(dá)患者之間無明顯差異(P=0.061)。在p TNM III/IV分期的肺癌患者中,NOK蛋白陰性表達(dá)的患者生存時(shí)間與陽性表達(dá)患者之間無明顯差異(P=0.144)。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型的單因素和多因素分析結(jié)果顯示,NOK蛋白的表達(dá)是影響肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。2.基因測(cè)序,q RT-PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NOK過/低表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室遷移結(jié)果顯示過表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系遷移能力增強(qiáng),低表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系遷移能力減弱。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng),低表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞侵襲能力減弱。3.q RT-PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在過表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系中,EMT標(biāo)志物E-cadherin的基因和蛋白表達(dá)水平降低、Vimentin基因和蛋白表達(dá)水平升高;在低表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系中,EMT標(biāo)志物E-cadherin的基因和蛋白表達(dá)水平升高、Vimentin基因和蛋白表達(dá)水平降低。4.在H520細(xì)胞中加入雌激素后,NOK基因的表達(dá)水平逐漸升高,在12h時(shí)達(dá)到峰值;在Calu-1細(xì)胞中加入雌激素后,NOK基因的表達(dá)水平則逐漸降低,12h后逐步回升。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:在距離NOK轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-1051bp,-1781bp,-2410bp存在著3個(gè)潛在的雌激素應(yīng)答原件。結(jié)論:1.通過臨床研究,我們發(fā)現(xiàn)NOK在肺癌組織中有較高的陽性表達(dá)率,其表達(dá)和肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p TNM分期等臨床要素相關(guān),是影響肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。2.在細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中,我們進(jìn)一步證實(shí)NOK可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,同時(shí)其表達(dá)變化能夠影響肺癌細(xì)胞的EMT過程。3.我們首次發(fā)現(xiàn)雌激素在肺癌細(xì)胞中能夠調(diào)節(jié)NOK基因的表達(dá),這可能是雌激素參與肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。由此我們首次提出了雌激素-NOK-EMT-肺癌轉(zhuǎn)移的新的潛在肺癌致病機(jī)制,有望為肺癌轉(zhuǎn)移的治療提供一個(gè)新的思路。
【關(guān)鍵詞】：NOK 非小細(xì)胞肺癌 癌基因
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-39
• 第一部分 NOK與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性的臨床研究39-49
• 1 材料39
• 2 方法39-41
• 2.1 入組病例及標(biāo)本的篩選39-40
• 2.2 免疫組織化學(xué)40
• 2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定40
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法40-41
• 3 結(jié)果41-46
• 3.1 入組患者的一般資料41-42
• 3.2 NOK免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定42
• 3.3 NOK蛋白表達(dá)和臨床要素的相關(guān)性42-44
• 3.4 NOK蛋白表達(dá)對(duì)肺癌患者預(yù)后的影響44-46
• 4 討論46-49
• 第二部分 NOK對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移及侵襲的影響49-68
• 1 材料49-50
• 2 方法50-60
• 2.1 NOK過表達(dá)細(xì)胞系的建立50-53
• 2.2 NOK低表達(dá)細(xì)胞系的建立53-55
• 2.3 NOK過/低表達(dá)細(xì)胞系的鑒定55-58
• 2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)58-59
• 2.5 Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)59-60
• 3 結(jié)果60-65
• 3.1 NOK全長(zhǎng)質(zhì)粒及慢病毒載體的鑒定60
• 3.2 NOK過表達(dá)細(xì)胞系的鑒定60-61
• 3.3 NOK低表達(dá)細(xì)胞系的鑒定61-63
• 3.4 NOK基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞遷移能力的影響63-65
• 3.5 NOK基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞侵襲能力的影響65
• 4 討論65-68
• 第三部分 NOK在肺癌細(xì)胞EMT過程中的作用68-76
• 1 材料68-69
• 2 方法69-72
• 2.1 q RT-PCR法檢測(cè)EMT標(biāo)志物的基因表達(dá)69-70
• 2.2 Western Blot法檢測(cè)EMT標(biāo)志物的蛋白表達(dá)70-72
• 3 結(jié)果72-73
• 3.1 NOK對(duì)EMT標(biāo)志物基因表達(dá)的影響72-73
• 3.2 NOK對(duì)EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響73
• 4 討論73-76
• 第四部分 雌激素在肺癌細(xì)胞中對(duì)NOK表達(dá)的調(diào)控作用76-86
• 1 材料76
• 2 方法76-79
• 2.1 不同濃度雌激素刺激肺癌細(xì)胞76-77
• 2.2 q RT-PCR法檢測(cè)NOK的基因表達(dá)77-78
• 2.3 Western Blot法檢測(cè)NOK的蛋白表達(dá)78-79
• 3 結(jié)果79-83
• 3.1 雌激素刺激對(duì)NOK基因表達(dá)的影響79-80
• 3.2 雌激素刺激對(duì)NOK蛋白表達(dá)的影響80-81
• 3.3 生物信息學(xué)分析雌激素對(duì)NOK的調(diào)控位點(diǎn)81-83
• 4 討論83-86
• 小結(jié)86-89
• 參考文獻(xiàn)89-102
• 附錄102-104
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果104-105
• 致謝105

  本文關(guān)鍵詞：NOK在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：387185