本文關(guān)鍵詞：TXNIP調(diào)控Kupffer細(xì)胞中NLRP3炎癥小體通路激活在進(jìn)展過程中的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分：Kupffer細(xì)胞及IL-1β與患者NAFLD進(jìn)展的關(guān)系目的：比較單純性脂肪肝(NAFL)與脂肪性肝炎(NASH)患者的臨床血清學(xué)指標(biāo)及組織病理學(xué)結(jié)果,初步探討Kupffer細(xì)胞(KCs)及IL-1β與NASH發(fā)生的關(guān)系。方法：根據(jù)NAFLD納入及排除標(biāo)準(zhǔn),收集高度懷疑或術(shù)前影像學(xué)診斷為NAFLD患者的肝臟標(biāo)本,首先制作石蠟切片進(jìn)行HE染色,通過NAFLD活動(dòng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將患者分為正常組、NAFL組及NASH組,其次比較各組患者血清轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯、游離脂肪酸(FFA)及IL-1β的水平,最后通過F4/80免疫組化及天狼星紅染色法,觀察各組肝組織中KCs的聚集情況及膠原纖維的增生情況。結(jié)果：(1)本次共收集8例肝臟標(biāo)本,經(jīng)NAS評(píng)分診斷NASH3例,NAFL3例,正常肝臟2例。(2)正常組及NAFL組患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯、FFA水平均在正常范圍內(nèi),血清IL-1β低于檢測(cè)下限。NASH組患者血清ALT、AST及甘油三脂均在正常參考值范圍,FFA及IL-1p水平高于正常組及NAFL組(P0.05)。(3) NAFL及NASH肝組織F4/80表達(dá)陽性細(xì)胞(KCs)較正常肝臟組織明顯增多,在肝細(xì)胞脂肪變的區(qū)域KCs聚集較多；天狼星紅染色結(jié)果顯示NASH組肝組織膠原纖維增生程度較NAFL及正常肝臟組無明顯增加。結(jié)論：血清FFA、KCs及促炎因子IL-1β可能參與人體NAFL向NASH的發(fā)展。第二部分：抑制TXNIP與NLRP3基因的表達(dá)對(duì)Kupffer細(xì)胞中NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響目的：觀察敲除小鼠硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因與NLRP3基因?qū)FA激活NLRP3炎癥小體及促進(jìn)促炎因子IL-1p分泌的影響,探討FFA激活NLRP3炎癥小體的具體機(jī)制。方法：取野生型(WT) C57BL/6小鼠、NLRP3-/-小鼠及TXNIP-/-小鼠,采用肝臟在體PBS灌注,離體膠原酶消化、梯度離心聯(lián)合選擇性貼壁法分離各組小鼠KCs, F4/80免疫熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)鑒定KCs的純度,吞墨實(shí)驗(yàn)判斷KCs的吞噬功能,光鏡下動(dòng)態(tài)觀察KCs隨時(shí)間的形態(tài)變化。將分離培養(yǎng)48 h的KCs以2-3×106密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶及激光共聚焦培養(yǎng)皿中,并隨機(jī)分為2組：①FFA組(FFA Group):給予濃度為0.3 mM的棕櫚酸(Palmitic acid, PA)刺激；②對(duì)照組(CONGroup):不給予任何刺激。于處理后8h收獲細(xì)胞。光鏡及透射電鏡觀察KCs的形態(tài)變化,熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)TXNE、NLRP3、ASC及Caspase-1 mRNA表達(dá)變化,Western blotting檢測(cè)TXND、 NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達(dá)水平,激光共聚焦檢測(cè)TXNIP、 NLRP3及Caspase-1的表達(dá)情況,ELISA法測(cè)定KCs培養(yǎng)上清液中IL-1β水平。結(jié)果：(1)免疫熒光染色可見KCs細(xì)胞膜高表達(dá)F4/80分子,提取的KCs純度大于90%,吞墨實(shí)驗(yàn)可見KCs吞噬大量碳素顆粒。(2)FFA組與CON組KCs光鏡下形態(tài)無明顯差異,透射電鏡下可見FFA組KCs吞噬大量脂滴。(3)WT小鼠FFA組與CON組TXNIP.ASC及Caspase-1的mRNA表達(dá)量無顯著性差異(P0.05),FFA組NLRP3的mRNA表達(dá)水平略高于CON組(P0.05),NLRP3-/-小鼠FFA組TXNIP、ASC及Caspase-1的mRNA表達(dá)量高于CON組(P0.05),TXNTP-/-小鼠FFA組NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA表達(dá)量較CON組顯著增高(P0.01)。(4)WT小鼠FFA組TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)量較CON組明顯增高(P0.05),NLRP3-/-小鼠FFA組TXNIP、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)量與CON組相比無顯著性差異(P0.05),TXNIP-/-小鼠FFA組NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)量較CON組顯著增高(P0.05)。(5)激光共聚焦結(jié)果示W(wǎng)T小鼠FFA組KCs中TXNIP、NLRP3及Caspase-1的熒光強(qiáng)度較CON組明顯增高,TXNIP-/-.小鼠FFA組NLRP3及Caspase-1的熒光強(qiáng)度較CON組亦明顯升高,NLRP3-/-小鼠FFA組TXNIP及Caspase-1的熒光強(qiáng)度較CON組僅輕度升高。(6)WT及TXNIP-/-小鼠FFA組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的水平較CON組明顯增高(P0.05),NLRP3-/-小鼠FFA組IL-1β的水平較CON組僅輕度增高,兩組比較無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:FFA可激活WT及TXNIP-/-小鼠KCs中NLRP3炎癥小體,促進(jìn)KCs分泌IL-1β,敲除小鼠NLRP3基因后可明顯抑制FFA刺激導(dǎo)致的KCs中NLRP3炎癥小體的激活及IL-1β的分泌。第三部分：抑制TXNIP與NLRP3基因的表達(dá)對(duì)小鼠單純性脂肪肝及脂肪性肝炎形成的影響目的：通過建立NAFL與NASH小鼠模型,探討TXNIP與NLRP3炎癥小體在小鼠NAFL與NASH形成過程中的作用。方法：分別用普通飼料(ND)及蛋氨酸膽堿缺乏的飼料(MCD)飼料喂養(yǎng)WT小鼠、TXNIP-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠四周,用高脂飼料(HFD)喂養(yǎng)WT小鼠、TXNIP-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠八周。每周稱小鼠體重,喂養(yǎng)結(jié)束后稱肝臟重量,檢測(cè)小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶、FFA及IL-1β的水平,蘇木素伊紅染色法(HE染色)及油紅染色法觀察肝組織病理變化,透射電鏡觀察WT小鼠肝組織的形態(tài)變化,免疫組織化學(xué)法觀察F4/80在肝組織中的表達(dá)情況,激光共聚焦檢測(cè)肝組織中TXNIP、NLRP3及Caspase-1的表達(dá)情況。提取各組小鼠KCs,Western blotting檢測(cè)TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)水平,免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)TXNIP、 NLRP3、ASC及Caspase-1的相互作用情況。結(jié)果：(1)WT小鼠、NLRP3-/-小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD組血清ALT及AST較ND組明顯增高(P0.05),HFD組較ND組僅輕度增高,無顯著性差異(P0.05)；WT小鼠HFD組與MCD組血清FFA水平較ND組明顯增高(P0.05),NLRP3-/-小鼠與TXNIP-/-小鼠各組血清中FFA水平無顯著性差異(P0.05)；WT小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD組血清IL-1β水平明顯高于ND組及HFD組(P0.01),NLRP3-/-小鼠MCD組血清IL-1p水平較ND組及HFD組僅輕度增高,差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)WT小鼠及TXNIP-/-小鼠HE染色及油紅染色示HFD組NAFL形成,肝細(xì)胞有脂肪變,炎癥不明顯,氣球樣變少見,MCD組NASH形成,肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死,有較多炎癥細(xì)胞浸潤,MCD組肝臟F4/80表達(dá)陽性細(xì)胞(KCs)較ND組及HFD組明顯增多。WT小鼠肝組織透射電鏡結(jié)果示MCD組肝細(xì)胞腫脹,胞漿內(nèi)有較多脂滴,伴有肝細(xì)胞壞死,部分肝血竇被破壞,紅細(xì)胞進(jìn)入肝細(xì)胞間隙。NLRP3-/-小鼠HFD組亦有NAFL形成,肝細(xì)胞脂肪變,肝血竇壓縮變窄,炎癥細(xì)胞浸潤較少,MCD組肝細(xì)胞壞死及炎癥程度較輕,未形成典型NASH,MCD組肝臟F4/80表達(dá)陽性細(xì)胞(KCs)與HFD組相比無明顯增多。(3)肝組織激光共聚焦結(jié)果示W(wǎng)T小鼠MCD組TXNIP.NLRP3及Caspase-1的表達(dá)水平較ND組明顯增高,TXNIP-/-小鼠MCD組NLRP3及Caspase-1的表達(dá)水平較ND組亦明顯增高,NLRP3-/-小鼠MCD組TXNIP及Caspase-1的表達(dá)水平較ND組僅輕度增高。(4)Westem blotting結(jié)果示W(wǎng)T小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD組KCs中NLRP3.ASC及Caspase-1蛋白表達(dá)水平較ND組及HFD組明顯增高(P0.05),ND組與HFD組之間無顯著性差異(P0.05)。NLRP3-/-小鼠MCD組ASC及Caspase-1的蛋白表達(dá)量與ND組及HFD組相比無顯著性差異(P0.05)。(5)免疫共沉淀結(jié)果示W(wǎng)T小鼠MCD組KCs中NLRP3炎癥小體共聚體的量較ND組及HFD組明顯增多(P0.05),ND組及HFD組間無顯著性差異(P0.05),KCs中TXNIP亦可與NLRP3形成共聚體,MCD組TXNIP的表達(dá)量較ND組及HFD組僅輕度增加,比較無顯著性差異(P0.05)；TXNIP-/-小鼠MCD組KCs中仍可形成NLRP3炎癥小體共聚體,共聚體的量較ND組明顯增多(P0.05)；NLRP3-/-小鼠MCD組KCs中仍有少量ASC-Caspase-1共聚體形成,共聚體的量較ND組僅輕度增加(P0.05)。結(jié)論：FFA可通過激活KCs中NLRP3炎癥小體,促進(jìn)KCs分泌IL-1p,誘導(dǎo)WT小鼠NASH形成,敲除小鼠TXNIP基因并不能阻止NASH的形成,敲除小鼠NLRP3基因可明顯抑制KCs中NLRP3炎癥小體的激活及IL-1β的分泌,阻止NAFL進(jìn)展為NASH。
【關(guān)鍵詞】：NLRP3炎癥小體 硫氧還蛋白相互作用蛋白 非酒精性脂肪性肝病 Kupffer細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照6-9
• 中文摘要9-15
• 英文摘要15-22
• 前言22-28
• 參考文獻(xiàn)26-28
• 第一部分：Kupffer細(xì)胞及IL-1β與患者NAFLD進(jìn)展的關(guān)系28-39
• 前言28-29
• 1 材料與方法29-32
• 2 結(jié)果32-35
• 3 討論35-36
• 4 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 第二部分：抑制TXNIP與NLRP3基因的表達(dá)對(duì)Kupffer細(xì)胞中NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響39-72
• 前言39
• 1 材料與方法39-50
• 2 結(jié)果50-64
• 3 討論64-67
• 4 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-70
• 附圖：KCs的分離過程70-72
• 第三部分：抑制TXNIP與NLRP3基因的表達(dá)對(duì)小鼠NAFL及NASH形成的影響72-103
• 前言72-73
• 1 材料與方法73-80
• 2 結(jié)果80-95
• 3 討論95-98
• 4 結(jié)論98-99
• 參考文獻(xiàn)99-101
• 附圖：IP過程101-103
• 全文總結(jié)103-104
• 文獻(xiàn)綜述104-111
• 參考文獻(xiàn)108-111
• 致謝111-112
• 攻讀博士期間發(fā)表論文112-113
• 攻讀博士期間參與的科研課題113

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  本文關(guān)鍵詞：TXNIP調(diào)控Kupffer細(xì)胞中NLRP3炎癥小體通路激活在進(jìn)展過程中的分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：387183