肺癌發(fā)病率和死亡率位于世界上各癌癥之首,非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌總數(shù)的80%,存活率很低�；�、靶向治療和免疫治療是晚期肺癌的主要治療手段,然而這些手段的有效性有限、毒副作用大,這大大降低了病人的生活質(zhì)量。因此,發(fā)展新型高效的、低毒的抗腫瘤藥物意義重大。本研究中我們從南極分離的隱球酵母Cryptococcus heimaeyensis S20中提取了胞外多糖,并對它在非小細胞肺癌中的抗腫瘤活性和機制進行了初步研究。隱球酵母屬廣泛分布在寒冷干旱的環(huán)境中,主要靠產(chǎn)生胞外多糖等方式來保護自己。菌株Cryptococcus heimaeyensis S20是從南極洲分離的,到目前為止,其胞外多糖(CHEPS)的結(jié)構(gòu)和相關(guān)生物活性還沒有被系統(tǒng)研究過。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)CHEPS能夠有效抑制NSCLC細胞活性,而對正常的人胚肺成纖維細胞WI-38和MRC-5的抑制效果較弱。進一步的研究發(fā)現(xiàn),CHEPS通過上調(diào)周期調(diào)控蛋白p53和p21的表達以及下調(diào)Cyclin B1、CDK1、Cyclin A2和CDK2的表達,有效誘導(dǎo)了NSCLC細...

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 肺癌
        1.1.1 流行病學(xué)與分類
        1.1.2 臨床表現(xiàn)與病因
        1.1.3 診斷
        1.1.4 分期
        1.1.5 治療
        1.1.6 化學(xué)藥物治療
        1.1.7 靶向藥物治療
        1.1.8 免疫治療
    1.2 胞外多糖
        1.2.1 概述
        1.2.2 多糖的應(yīng)用
        1.2.3 多糖的抗腫瘤活性
        1.2.4 隱球酵母胞外多糖研究進展
    1.3 細胞自噬
        1.3.1 定義與分類
        1.3.2 具體階段及相關(guān)調(diào)控基因
        1.3.3 自噬與細胞命運
        1.3.4 細胞自噬與癌癥
        1.3.5 細胞自噬相關(guān)信號通路
        1.3.6 細胞自噬的檢測技術(shù)
    1.4 本研究的目的和意義
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞系和菌株
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 試劑與耗材
        2.1.4 抗體
        2.1.5 質(zhì)粒
        2.1.6 主要實驗儀器
        2.1.7 主要試劑的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 pEGFP-LC3過表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 pSUPER-shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.3 細胞基本操作
        2.2.4 干擾質(zhì)粒穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建
        2.2.5 細胞總RNA的提取及實時熒光定量PCR
        2.2.6 Western Blot蛋白免疫印跡實驗
        2.2.7 細胞活性檢測
        2.2.8 克隆形成率檢測
        2.2.9 細胞周期檢測
        2.2.10 細胞凋亡檢測
        2.2.11 細胞自噬檢測
        2.2.12 活性氧(ROS)檢測
        2.2.13 組織病理學(xué)和免疫組化檢測
        2.2.14 動物實驗方案
        2.2.15 統(tǒng)計學(xué)分析
3 實驗結(jié)果
    3.1 CHEPS有效抑制了NSCLC細胞的生長
        3.1.1 CHEPS對細胞形態(tài)的影響
        3.1.2 CHEPS對細胞活性的影響
    3.2 CHEPS能夠通過調(diào)控細胞周期蛋白的表達誘導(dǎo)NSCLC細胞S和G2/M期停留
        3.2.1 CHEPS誘導(dǎo)了NSCLC細胞S和G2/M期停
        3.2.2 CHEPS能夠調(diào)控細胞周期相關(guān)基因的表達
    3.3 CHEPS不能誘導(dǎo)細胞凋亡
        3.3.1 CHEPS不能誘導(dǎo)磷脂酰絲氨酸外翻
        3.3.2 CHEPS不能調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達和剪切
    3.4 CHEPS誘導(dǎo)了細胞自噬的發(fā)生
        3.4.1 CHEPS能夠誘導(dǎo)EGFP-LC3聚集
        3.4.2 CHEPS誘導(dǎo)了大量自噬溶酶體的生成
        3.4.3 細胞自噬的透射電鏡觀察
        3.4.4 CHEPS調(diào)控了自噬相關(guān)基因的表達
    3.5 CHEPS誘導(dǎo)了自噬潮的發(fā)生
        3.5.1 CHEPS能夠誘導(dǎo)細胞自噬的起始和組裝
        3.5.2 CHEPS能夠誘導(dǎo)自噬小體和溶酶體的融合
        3.5.3 CHEPS能夠誘導(dǎo)自噬溶酶體中自噬底物的降解
    3.6 CHEPS能夠誘導(dǎo)NSCLC細胞自噬性死亡
    3.7 CHEPS不通過PI3K/AKT途徑抑制細胞活性
    3.8 CHEPS不通過AMPK途徑抑制細胞活性
        3.8.1 CHEPS激活了AMPK信號通路
        3.8.2 AMPK不能調(diào)控CHEPS誘導(dǎo)的細胞自噬和死亡
    3.9 CHEPS通過p38和ERK信號通路誘導(dǎo)細胞死亡
        3.9.1 CHEPS激活了p38、ERK和JNK信號通路
        3.9.2 p38和ERK促進了CHEPS誘導(dǎo)的細胞死亡
    3.10 p38和ERK調(diào)控了CHEPS誘導(dǎo)的細胞周期停留和自噬
        3.10.1 ERK促進了CHEPS誘導(dǎo)的S和G2/M期停留
        3.10.2 p38和ERK促進了CHEPS誘導(dǎo)的細胞自噬
    3.11 CHEPS通過ROS信號誘導(dǎo)細胞死亡
        3.11.1 CHEPS誘導(dǎo)了NSCLC細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生
        3.11.2 ROS的產(chǎn)生促進了CHEPS誘導(dǎo)的NSCLC細胞死亡
    3.12 ROS通過p38/ERK介導(dǎo)的細胞自噬促進CHEPS誘導(dǎo)的NSCLC細胞死亡
        3.12.1 ROS不是通過細胞周期停留途徑抑制CHEPS相關(guān)細胞生長
        3.12.2 ROS通過細胞自噬途徑誘導(dǎo)CHEPS相關(guān)細胞死亡
        3.12.3 ROS促進了CHEPS誘導(dǎo)的p38和ERK磷酸化
    3.13 CHEPS在動物體內(nèi)通過ROS介導(dǎo)的p38/ERK信號通路誘導(dǎo)NSCLC細胞自噬性細胞死亡
        3.13.1 CHEPS抑制了NSCLC細胞移植瘤在動物體內(nèi)的生長
        3.13.2 CHEPS對裸鼠體重和器官沒有明顯毒副作用
        3.13.3 CHEPS能夠誘導(dǎo)動物體內(nèi)肺癌細胞移植瘤細胞自噬
        3.13.4 CHEPS誘導(dǎo)動物體內(nèi)肺癌細胞移植瘤中p38和ERK的磷酸化及ROS的產(chǎn)生
    3.14 CHEPS誘導(dǎo)NSCLC細胞死亡模式圖
4 討論
參考文獻
縮略詞
博士研究生期間已發(fā)表或待發(fā)表的科研論文
致謝



本文編號：3837532