本文關鍵詞：黃芪活性物質篩選及基于PKC-ERK信號通路抑制肺癌的作用機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肺癌已發(fā)展為全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥。絕大多數(shù)的肺癌患者在確診時已屬中晚期。侵襲轉移是肺癌治療失敗和復發(fā)的主要因素。因此選擇具有抑制肺癌侵襲轉移的化合物進行物質基礎及作用機理研究,有助于理解中醫(yī)藥抗腫瘤的科學內涵。本課題基于中醫(yī)整體觀和“組分結構”理論,通過抗腫瘤活性篩選,選擇具有良好療效的黃芪作為研究對象,采用細胞膜固相化,對靶點結合成分進行分離與識別,體外進行抑制A549細胞遷移侵襲及機制實驗,體內研究活性成分的體內代謝,并采用現(xiàn)代藥劑學手段制備高效的抗腫瘤靶向制劑,為揭示黃芪抗肺癌遷移侵襲物質基礎提供了科學依據(jù)。主要內容包括以下幾個部分：抗肺癌藥物篩選研究研究金復康口服液藥材抑瘤效果,發(fā)現(xiàn)金復康口服液具有抑制肺癌效果,隨著用量的增加,金復康口服抑瘤效果增強,并呈現(xiàn)一定的劑量關系；敲出黃芪后整方的抑瘤效果明顯降低。多批藥材多次重復篩選結果顯示黃芪抑瘤率均大于30%,具有良好的抗肺癌效果。黃芪抑制肺癌物質基礎細胞膜固相化研究建立A549細胞膜固相篩選體系,通過UPLC-q-TOF-MS2技術尋找、辨別和歸屬效應物質標志峰,比較不同時間、不同濃度對細胞膜固相化影響,確定條件為：2×10-4 mg/mL黃芪與A549細胞共孵育60min。最終識別出6個黃芪中化合物成分為細胞膜固相化活性產(chǎn)物,分別是：毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、刺芒柄花素-7-O-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、刺芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ。黃芪皂苷抑制肺癌細胞侵襲轉移研究黃芪甲苷對A549細胞增殖具有抑制作用,抑制A549細胞粘附。黃芪甲苷在劃痕、transwell實驗中能夠有效抑制細胞侵襲、轉移。黃芪甲苷能夠抑制細胞上清液中炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-6的水平,影響腫瘤細胞微環(huán)境。黃芪甲苷抑制MMP-2, MMP-9, Integrin β1蛋白,增加E-cad蛋白表達,增強細胞粘附,降低轉移能力。信號通路蛋白顯示黃芪甲苷能明顯抑制PKC-α(membrane), p-ERK1/2, NF-κB蛋白表達實現(xiàn)抑制A549細胞的遷移和侵襲。黃芪甲苷抑制PKC-α細胞膜易位,黃芪甲苷聯(lián)用AEB071可以抑制A549的PKC-α過表達,進一步抑制MMP-2、MMP-9和Integrin β1的表達水平同時增加E-cad表達水平,抑制A549細胞侵襲轉移。黃芪甲苷抑制ERK1/2磷酸化,黃芪甲苷聯(lián)用U0126可以抑制A549的ERK1/2磷酸化,進一步抑制MMP-2、MMP-9和Integrin β1的表達水平同時增加E-cad表達水平,抑制A549細胞侵襲轉移。黃芪甲苷聯(lián)用PDTC可以抑制A549的NF-κB (p65)表達,進一步抑制MMP-2、MMP-9和Integrin β1的表達水平同時增加E-cad表達水平,抑制A549細胞侵襲轉移。結果證實黃芪甲苷可能通過抑制PKC-α-ERK1/2-NF-κB信號通路抑制A549細胞侵襲轉移。黃芪黃酮抑制肺癌細胞侵襲轉移研究毛蕊異黃酮對A549細胞增殖具有抑制作用,增加A549細胞凋亡。’統(tǒng)計結果表明,空白組細胞凋亡率為3.44%,20μM、30μM和40μM毛蕊異黃酮提高A549細胞凋亡從23.39%、33.61%和43.77%。毛蕊異黃酮對TPA誘導的A549細胞粘附、遷移和侵襲具有抑制作用。毛蕊異黃酮抑制Integrin β1、LnR、MMP-2和MMP-9水平,增加E-cadherin的水平,抑制A549細胞的轉移。TPA誘導后A549細胞中PKC-a蛋白表達明顯增加,加入毛蕊異黃酮可抑制PKC-a蛋白表達。毛蕊異黃酮抑制TPA誘導的ERK1/2磷酸化激活。毛蕊異黃酮聯(lián)用AEB071可以抑制TPA誘導的PKC-a過表達,進一步抑制MMP-2、MMP-9、LnR和Integrin β1的表達水平同時增加E-cad表達水平,抑制A549細胞侵襲轉移。毛蕊異黃酮聯(lián)用PD98059可以抑制TPA誘導的p-ERK1/2過表達,進一步抑制MMP-2、MMP-9、LnR和Integrin β1的表達水平同時增加E-cad表達水平,抑制A549細胞侵襲轉移。結果證實毛蕊異黃酮可能通過抑制PKC-a-ERKl/2信號通路抑制TPA誘導的A549細胞侵襲轉移。黃芪活性成分體內代謝研究建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS方法應用于灌胃黃芪大鼠血漿,膽汁,尿和糞便樣品中代謝物檢測。共有22代謝物檢測和初步鑒定,和其中15個進行了報道首次。大鼠黃芪甲苷的主要代謝途徑是去糖基化,硫化和葡萄糖醛酸化。制劑學研究提高黃芪活性成分抗肺癌效果制備毛蕊異黃酮納米膠束,平均粒徑為111.91±5.82nm, PDI 0.11±0.03,毛蕊異黃酮的包封率是89.54±1.49%。TPGS在0.1%吐溫80的PBS (pH 7.4)溶液中120小時釋放44.88±4.94%。毛蕊異黃酮在24小時內釋放90.95±3.78%的。細胞攝取實驗表明含有TPGS的納米膠束可以遞送模型藥物進入腫瘤細胞,發(fā)揮效果。細胞毒性結果也證實毛蕊異黃酮納米膠束相比毛蕊異黃酮在相同濃度下具有更好的抑制細胞存活效果。裸鼠活體成像結果顯示,在給藥后24h內DiR-標記納米膠束顯示良好的腫瘤靶向特性,24h裸鼠腫瘤部位仍保留較高濃度的DiR。DiR組給藥后靶向效果不明顯,呈現(xiàn)周身分布狀,給藥后24h內DiR較多地分布于裸鼠體內其他組織器官,而腫瘤部位分布較少。結果表明含TPGS納米膠束具有高的腫瘤靶向效率。體內荷瘤實驗結果顯示,毛蕊異黃酮納米膠束組腫瘤體積較空白組明顯減小,也小于游離毛蕊異黃酮組,大于順鉑組。游離毛蕊異黃酮治療組的中位存活率(中位生存,12天)比對照組(平均存活,10天)的毛蕊異黃酮納米膠束組的存活率顯著較高高于順鉑組。游離毛蕊異黃酮,毛蕊異黃酮納米膠束,順鉑組的抑瘤率分別為34.03%,67.39%,76.97和%,表明毛蕊異黃酮納米膠束能夠明顯提高毛蕊異黃酮抗腫瘤作用。順鉑組小鼠體重顯著下降(p0.05),毛蕊異黃酮組及毛蕊異黃酮納米膠束組的體重沒有顯著變化,而只這表明毛蕊異黃酮納米膠束是一種安全的生物試劑。從體內抗腫瘤試驗結果表明,毛蕊異黃酮的納米膠束有效地改善在荷瘤小鼠的抗腫瘤治療的功效和安全性�？偨Y本論文基于藥物活性篩選及細胞膜固相化實驗,篩選黃芪中具有抑制肺癌細胞侵襲轉移的化學成分,一定程度上揭示了黃芪抗腫瘤作用機制。根據(jù)活性成分生物藥劑學性質設計納米給藥系統(tǒng)實現(xiàn)了靶向給藥,為進一步利用提供了依據(jù)。
【關鍵詞】：黃芪 黃芪甲苷 毛蕊異黃酮 遷移 浸潤 肺腫瘤 肺癌
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 第一章 緒論14-34
• 1.1 研究背景、目的和意義14
• 1.1.1 研究背景14
• 1.1.2 研究目的14
• 1.2 肺癌藥物市場分析14-20
• 1.2.1 肺癌流行病學調查14-18
• 1.2.2 抗肺癌藥物市場研究18-20
• 1.3 中藥抗腫瘤研究機制進展20-22
• 1.4 藥效物質基礎研究新思路22-25
• 1.4.1 中藥復方物質基礎研究現(xiàn)狀22
• 1.4.2 中藥物質基礎研究新思路22-25
• 1.5 基于組分結構和多維質控中藥二次開發(fā)研究策略25-34
• 1.5.1 中藥二次開發(fā)研究現(xiàn)狀25-26
• 1.5.2 基于組分結構理論的中藥二次開發(fā)組方研究思路26-29
• 1.5.3 基于多維質控的中藥二次開發(fā)產(chǎn)業(yè)提升思路29-34
• 第二章 金復康抗肺癌藥物篩選及優(yōu)化34-42
• 2.1 儀器及試劑34-35
• 2.2 實驗方法35-36
• 2.3 金復康拆方研究36-37
• 2.3.1 實驗結果36-37
• 2.3.2 本節(jié)小結37
• 2.4 抗肺癌藥物篩選及優(yōu)化研究37-40
• 2.4.1 實驗結果37-40
• 2.4.2 本節(jié)小結40
• 2.5 本章小結40-42
• 第三章 黃芪抗肺癌物質基礎細胞膜固相化研究42-51
• 3.1 儀器及試劑42
• 3.2 細胞固相篩選體系的構建42-43
• 3.2.1 細胞培養(yǎng)與固相化42-43
• 3.2.2 樣品處理43
• 3.2.3 色譜條件43
• 3.2.4 質譜條件43
• 3.3 不同濃度黃芪對固相成分的影響43-44
• 3.3.1 結果與討論43-44
• 3.4 不同時間對固相成分的影響44-45
• 3.4.1 結果與討論44-45
• 3.5 細胞膜固相黃芪產(chǎn)物檢測45-50
• 3.5.1 孵育液中化學成分識別45-47
• 3.5.2 細胞膜固相化活性成分鑒定結果47-50
• 3.6 本章小結50-51
• 第四章 黃芪皂苷抑制肺癌細胞侵襲轉移研究51-68
• 4.1 儀器與試劑51-52
• 4.1.1 儀器51
• 4.1.2 試劑及耗材51-52
• 4.1.3 溶液配制52
• 4.2 黃芪甲苷對A549細胞增殖的影響52-53
• 4.2.1 MTT法測定黃芪甲苷對A549細胞增殖率的影響52
• 4.2.2 結果與討論52-53
• 4.2.3 本節(jié)小結53
• 4.3 黃芪甲苷對A549細胞粘附的影響53-54
• 4.3.1 實驗方法53
• 4.3.2 結果與討論53-54
• 4.3.3 本節(jié)小結54
• 4.4 黃芪甲苷對A549細胞遷移的影響54-56
• 4.4.1 劃痕試驗54
• 4.4.2 Transwell遷移實驗54-55
• 4.4.3 結果與討論55-56
• 4.4.4 本節(jié)小結56
• 4.5 黃芪甲苷對A549細胞侵襲的影響56-58
• 4.5.1 實驗方法56-57
• 4.5.2 結果與討論57-58
• 4.5.3 本節(jié)小結58
• 4.6 黃芪甲苷對A549炎癥因子的影響58-59
• 4.6.1 實驗方法58
• 4.6.2 結果與討論58-59
• 4.6.3 本節(jié)小結59
• 4.7 黃芪甲苷對A549細胞粘附因子的影響59-61
• 4.7.1 Western blot檢測MMP-2,MMP-9,E-cad,Integrin β1蛋白表達59
• 4.7.2 結果與討論59-60
• 4.7.3 本節(jié)小結60-61
• 4.8 黃芪甲苷對PKC-ERK1/2-NF-κB信號蛋白的影響61-63
• 4.8.1 Western blot檢測PKC-α,p-ERK1/2,ERK1/2,NF-κB蛋白表達61
• 4.8.2 結果與討論61-62
• 4.8.3 本節(jié)小結62-63
• 4.9 信號通路抑制劑對黃芪作用于A549細胞的影響63-66
• 4.9.1 PKC-α,p-ERK1/2,ERK1/2,NF-κB抑制劑對黃芪甲苷抑制信號通路的影響63
• 4.9.2 Transwell 檢測 PKC-a, P-ERK1/2, ERK1/2, NF-kB 抑制劑對黃茂甲巧抑制 A549細胞侵襲的影響63
• 4.9.3 結果與討論63-66
• 4.9.4 本節(jié)小結66
• 4.10 本章小結66-68
• 第五章 黃芪黃酮抑制肺癌細胞侵襲轉移研究68-86
• 5.1 儀器及試劑68-69
• 5.1.1 儀器68-69
• 5.1.2 試劑及耗材69
• 5.1.3 溶液配制69
• 5.2 毛蕊異黃酮對A549細胞增殖的影響69-70
• 5.2.1 實驗方法69
• 5.2.2 結果與討論69-70
• 5.2.3 本節(jié)小結70
• 5.3 毛蕊異黃酮對A549細胞凋亡的影響70-72
• 5.3.1 流式細胞儀測定毛蕊異黃酮誘導的A549細胞凋亡70
• 5.3.2 結果與討論70-71
• 5.3.3 本節(jié)小結71-72
• 5.4 毛蕊異黃酮對A549細胞粘附的影響72-73
• 5.4.1 實驗方法72
• 5.4.2 統(tǒng)計學分析72
• 5.4.3 結果與討論72-73
• 5.4.4 本節(jié)小結73
• 5.5 毛蕊異黃酮對A549細胞遷移的影響73-75
• 5.5.1 劃痕試驗73
• 5.5.2 Transwell遷移實驗73-74
• 5.5.3 結果與討論74-75
• 5.5.4 本節(jié)小結75
• 5.6 毛蕊異黃酮對A549細胞侵襲的影響75-76
• 5.6.1 Transwell侵襲實驗75
• 5.6.2 結果與討論75-76
• 5.6.3 本節(jié)小結76
• 5.7 毛蕊異黃酮對A549細胞粘附因子的影響76-79
• 5.7.1 Western blot檢測MMP-2,MMP-9,E-cad,Integrin β1蛋白表達76
• 5.7.2 結果與討論76-79
• 5.7.3 本節(jié)小結79
• 5.8 毛蕊異黃酮對PKC-ERK1/2信號蛋白的影響79-81
• 5.8.1 Western blot檢測PKC-α,p-ERK1/2,ERK1/2,NF-κB蛋白表達79
• 5.8.2 結果與討論79-80
• 5.8.3 本節(jié)小結80-81
• 5.9 信號通路抑制劑對黃芪作用于A549細胞的影響81-84
• 5.9.1 PKC-α,p-ERK1/2,ERK1/2抑制劑對毛蕊異黃酮抑制信號通路的影響81
• 5.9.2 Transwell檢測PKC-0, P-ERK1/2, ERK1/2抑制劑對毛蕊異黃r>抑制A549細胞侵襲的影響81
• 5.9.3 結果與討論81-84
• 5.9.4 本節(jié)小結84
• 5.10 本章小結84-86
• 第六章 黃芪活性成分體內代謝研究86-100
• 6.1 儀器及試劑86-87
• 6.2 實驗方法87-88
• 6.2.1 樣品收集87
• 6.2.2 樣品制備87-88
• 6.2.3 色譜及質譜條件88
• 6.3 統(tǒng)計學分析88
• 6.4 結果與討論88-99
• 6.4.1 離子模式的選擇88-89
• 6.4.2 代謝產(chǎn)物識別89-93
• 6.4.3 代謝物鑒定93-99
• 6.5 本章小結99-100
• 第七章 提高黃芪活性成分抗腫瘤效果制劑學研究100-111
• 7.1 儀器及試劑100-101
• 7.1.1 儀器100-101
• 7.1.2 試劑101
• 7.1.3 動物101
• 7.1.4 細胞培養(yǎng)101
• 7.2 實驗方法101-103
• 7.2.1 毛蕊異黃酮納米膠束的制備101-102
• 7.2.2 粒徑,多分散性,和Zeta電位102
• 7.2.3 形態(tài)特征102
• 7.2.4 包封率的測定102
• 7.2.5 體外釋藥102
• 7.2.6 腫瘤靶向評估102-103
• 7.2.7 細胞攝取實驗103
• 7.2.8 細胞存活實驗103
• 7.2.9 體內抗腫瘤功效103
• 7.2.10 統(tǒng)計學分析103
• 7.3 結果與討論103-109
• 7.3.1 處方設計104
• 7.3.2 毛蕊異黃酮納米膠束制備和表征104-105
• 7.3.3 藥物包封率105
• 7.3.4 體外釋藥105-106
• 7.3.6 細胞攝取106-107
• 7.3.7 腫瘤靶向107
• 7.3.8 細胞毒性107-108
• 7.3.9 體內抗腫瘤功效108-109
• 7.4 討論109-110
• 7.5 本章小結110-111
• 第八章 結論與展望111-113
• 8.1 研究創(chuàng)新點111
• 8.2 主要結論111-112
• 8.3 工作展望112-113
• 參考文獻113-125
• 攻讀博士學位期間取得的研究成果125-126
• 致謝126-127
• 成旭東簡介127

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關鍵詞：黃芪活性物質篩選及基于PKC-ERK信號通路抑制肺癌的作用機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：381373