本文關(guān)鍵詞：加減補(bǔ)肺湯對博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化干預(yù)作用的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)發(fā)病率呈不斷上升趨勢,目前約為16.3/10萬,且3年內(nèi)急性惡化發(fā)生率為20.7%。PF的主要病理特點(diǎn)是初期廣泛性肺泡炎形成,后期大量成纖維細(xì)胞增生,以及基質(zhì)膠原進(jìn)行性積聚,最后取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)。發(fā)病機(jī)制尚不清,病死率高,目前缺乏有效藥物。本課題前期研究結(jié)果表明,加減補(bǔ)肺湯有抗氧化作用拮抗纖維的形成。但是加減補(bǔ)肺湯拮抗肺纖維化的具體分子機(jī)制目前尚不十分清楚。為闡明加減補(bǔ)肺湯對肺纖維化的作用及其可能的作用機(jī)制,本研究擬通過博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠為模型,觀察加減補(bǔ)肺湯對小鼠肺纖維化模型的病理形態(tài)學(xué)改變,檢測加減補(bǔ)肺湯對小鼠肺組織中TGF-β1、TNF-α、CatD、LC3和mTOR表達(dá)的影響,研究加減補(bǔ)肺湯對肺纖維化小鼠的作用,初步探討其抑制肺纖維化的機(jī)制。研究方法及結(jié)果1采用不同劑量的博萊霉素復(fù)制小鼠肺纖維化模型,探討復(fù)制小鼠肺纖維化模型的理想劑量。(1)方法:昆明種小鼠90只,隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型高(7.5mg/kg)、模型中(5mg/kg)和模型低(2.5mg/kg)劑量組,每組18只。模型組氣管內(nèi)單次注入博來霉素生理鹽水溶液,假手術(shù)組氣管內(nèi)單次注入等體積生理鹽水。各組動物分別于第3天、7天、14天處死,取肺組織進(jìn)行HE染色,觀察肺組織病理改變及死亡率。(2)結(jié)果1)博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型復(fù)制成功。2)博來霉素注入劑量與肺纖維化程度及死亡率呈正相關(guān)。3)小鼠肺纖維化模型的建立:采用經(jīng)氣管內(nèi)一次性給藥方法,用博萊霉素5mg/kg是較為理想的復(fù)制小鼠肺纖維化模型劑量。2加減補(bǔ)肺湯對博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,探討加減補(bǔ)肺湯抗小鼠肺纖維化的藥效。(1)方法:昆明小鼠306只,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、加減補(bǔ)肺湯高劑量組、加減補(bǔ)肺湯中劑量組、加減補(bǔ)肺湯低劑量組、醋酸潑尼松組和加減補(bǔ)肺湯中劑量+醋酸潑尼松組,假手術(shù)組36只,其余每組均為45只。除假手術(shù)組,其余各治療組及模型組氣管內(nèi)均單次注入博來霉素生理鹽水溶液(5mg/kg)復(fù)制小鼠肺纖維化模型,假手術(shù)組氣管內(nèi)單次注射等體積的生理鹽水。各治療組于造模后第二天開始給予相應(yīng)的藥物干預(yù),加減補(bǔ)肺湯高、中、低劑量組分別按12g/kg/d、6g/kg/d、3g/kg/d劑量給藥,醋酸潑尼松組按0.5mg/kg/d劑量給藥,加減補(bǔ)肺湯中劑量+醋酸潑尼松組:上午給加減補(bǔ)肺湯按6g/kg/d劑量給藥,下午醋酸潑尼松按0.5mg/kg/d劑量給藥;模型組和假手術(shù)組分別給予等量的生理鹽水灌胃。各組動物于第7天、14天、28天隨機(jī)取10只處死,取肺組織進(jìn)行he染色,觀察肺組織病理改變,對圖片進(jìn)行定量分析。(2)結(jié)果:he染色顯示,假手術(shù)組:肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰,未見炎癥細(xì)胞浸潤和肺實質(zhì)病變;模型組:肺泡間隔增寬變形,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,早期肺泡腔內(nèi)重度炎性細(xì)胞浸潤,晚期成纖維細(xì)胞大量增生,纖維組織呈條索樣改變,纖維化程度隨時間的進(jìn)展而加深加重;加減補(bǔ)肺湯高、中、低劑量組、醋酸潑尼松組和加減補(bǔ)肺湯中劑量+醋酸潑尼松組:肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰,在支氣管周圍有局部纖維化,肺泡間隔增厚,較模型組有所減輕。3加減補(bǔ)肺湯干預(yù)小鼠肺纖維化作用機(jī)制研究(1)方法:171只昆明小鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、加減補(bǔ)肺湯組和醋酸潑尼松組,假手術(shù)組36,其余各組均為45只。模型組、加減補(bǔ)肺湯組和醋酸潑尼松組,氣管內(nèi)注射博來霉素(5mg/kg)誘導(dǎo)肺纖維化;假手術(shù)組在相同條件下給予生理鹽水。造模后第二天開始給藥,加減補(bǔ)肺湯組按12g/kg/d劑量給藥,醋酸潑尼松組按0.5mg/kg/d劑量給藥;模型組和假手術(shù)組分別給等體劑生理鹽水灌胃。各組動物于第7、14、28天隨機(jī)取10只處死,取肺組織he染色,觀察肺組織病理改變。用免疫組化和westernblot方法,對于各組小鼠肺組織中tgf-β1、tnf-α、catd、lc3和mtor表達(dá)量進(jìn)行觀察,并用圖像分析軟件分析各組的平均光密度。(2)結(jié)果:1)tnf-α和tgf-β1免疫組化結(jié)果表明,tnf-α和tgf-β1在假手術(shù)組表達(dá)較弱;在模型組表達(dá)隨時間延長逐漸增強(qiáng),與假手術(shù)組比較有顯著差異(p0.01);加減補(bǔ)肺湯及醋酸潑尼松組在各時間點(diǎn)表達(dá)趨勢與模型組相同,但與模型組比較均有顯著差異(p0.01或p0.05);到第28d時,加減補(bǔ)肺湯組優(yōu)于強(qiáng)的松組,但兩組無明顯差異(p0.05)。第14d各組小鼠肺組織中tgf-β1和tnf-α的westernblot實驗結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致。2)catd免疫組化結(jié)果表明,假手術(shù)組在支氣管上皮細(xì)胞有少量catd表達(dá);博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠catd表達(dá)明顯增多,在肺間質(zhì)和支氣管上皮細(xì)胞中都有表達(dá),并且隨時間延長有增多的趨勢,第7天、14天和28天時與假手術(shù)組比較都有明顯差異(p0.01);強(qiáng)的松、加減補(bǔ)肺湯組:catd表達(dá)趨勢與模型組相同,但表達(dá)較模型組明顯減少,與模型組比較均有顯著差異(p0.01或p0.05)。3)通過對肺組織中l(wèi)c3表達(dá)情況的分析,我們發(fā)現(xiàn)lc3存在于正常肺組織的支氣管及血管周圍,且蛋白表達(dá)較弱,說明在正常組織細(xì)胞內(nèi)自噬功能較低;而在肺纖維化肺組織中,lc3除了見于支氣管及血管周圍以外,尚可見lc3在細(xì)胞漿中有陽性表達(dá),與假手術(shù)組比較,博萊霉素處理后各時間點(diǎn)小鼠肺組織中l(wèi)c3的表達(dá)均顯著升高(p0.01);加減補(bǔ)肺湯組lc3表達(dá)較模型組明顯降低,說明加減補(bǔ)肺湯能減少肺纖維化小鼠肺組織中l(wèi)c3的過度表達(dá)。4)mtor免疫組化結(jié)果表明,假手術(shù)組:mtor蛋白表達(dá)在支氣管、血管周圍,胞漿中有少許陽性表達(dá)。模型組:mtor表達(dá)明顯增多,胞漿中也有陽性表達(dá)。第7天、14天和28天時與假手術(shù)組比較都有顯著性差異(p0.01),提示模型組隨著肺纖維化程度加重mtor被激活。加減補(bǔ)肺湯組:表達(dá)趨勢與模型組相同,但表達(dá)較模型組明顯減少(p0.05),提示加減補(bǔ)肺湯能使肺纖維化小鼠肺組織中mTOR活性下降結(jié)論1用5mg/kg博萊霉素是較為理想的復(fù)制小鼠肺纖維化模型劑量。2加減補(bǔ)肺湯能改善肺纖維化小鼠炎性細(xì)胞浸潤,明顯減輕肺纖維化程度,從而干預(yù)肺纖維化的形成。3加減補(bǔ)肺湯干預(yù)小鼠肺纖維化作用機(jī)制研究(1)加減補(bǔ)肺湯能抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化肺組織TNF-α、TGF-β1蛋白的表達(dá),明顯減輕肺纖維化模型小鼠肺泡炎的發(fā)展及肺纖維化的形成。(2)加減補(bǔ)肺湯能減輕博萊霉素誘發(fā)的小鼠肺纖維化,其作用機(jī)制可能與抑制Cathepsin D的過度表達(dá)有關(guān)。(3)加減補(bǔ)肺湯能減少肺纖維化小鼠肺組織中LC3、mTOR的過度表達(dá),干預(yù)肺纖維化的形成。
【關(guān)鍵詞】：肺纖維化 加減補(bǔ)肺湯 TGF-β1 TNF-α Cat D LC3 mTOR
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• ABSTRACT9-16
• 英文縮略詞表16-17
• 前言17-19
• 第一部分 中醫(yī)文獻(xiàn)與理論研究19-24
• 1.中醫(yī)對肺纖維化的理論認(rèn)識19-21
• 2.中醫(yī)藥治療肺纖維化的臨床報道21-22
• 3.中醫(yī)藥治療肺纖維化的實驗研究22-23
• 4 討論23-24
• 第二部分 實驗研究24-125
• 實驗一 博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠動物模型的建立24-40
• 1. 前言24-25
• 2 材料與方法25-28
• 3.結(jié)果28-36
• 4.討論36-38
• 5.結(jié)論38-40
• 實驗二 加減補(bǔ)肺湯對肺纖維化小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的研究40-64
• 1.前言40-41
• 2.材料與方法41-46
• 3.結(jié)果46-60
• 4.討論60-63
• 5.結(jié)論63-64
• 實驗三 加減補(bǔ)肺湯對肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1、TNF-α表達(dá)的影響64-95
• 1.前言64-65
• 2.材料與方法65-77
• 3.結(jié)果77-90
• 4.討論90-93
• 5.結(jié)論93-95
• 實驗四 加減補(bǔ)肺湯對肺纖維化小鼠肺組織cathepsin D的影響95-109
• 1.前言95-96
• 2.材料與方法96-99
• 3.結(jié)果99-107
• 4.討論107-108
• 5.結(jié)論108-109
• 實驗五 加減補(bǔ)肺湯對肺纖維化小鼠自噬/溶酶體途徑中相關(guān)蛋白表達(dá)的研究109-125
• 1.前言109-110
• 2.材料與方法110-114
• 3.結(jié)果114-121
• 4.討論121-124
• 5.結(jié)論124-125
• 結(jié)語125-127
• 創(chuàng)新點(diǎn)127-128
• 參考文獻(xiàn)128-150
• 附錄一 綜述150-158
• 參考文獻(xiàn)154-158
• 附錄二 讀博期間發(fā)表文章158-159
• 致謝159

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：379764