心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是以心肌間質(zhì)或血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過(guò)度沉積為主要特征的一種病理反應(yīng)。研究表明,心肌纖維化是大多數(shù)心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)發(fā)展到終末期的必然生理過(guò)程。因此,阻斷或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化是治療心血管疾病的重要目標(biāo)之一。心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts,CFs)是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的中心細(xì)胞,其激活是心肌纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié),在心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。眾多細(xì)胞因子、信號(hào)通路參與調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞的激活,但其激活的確切機(jī)制仍在探索過(guò)程中。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始關(guān)注核轉(zhuǎn)錄因子在心肌纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。最新研究表明,孤兒核受體Nur77可負(fù)反饋調(diào)控多種實(shí)驗(yàn)性纖維化疾病,這也提示Nur77可能成為抗心肌纖維化的潛在靶點(diǎn)。野黃芩苷是一種黃酮類單體,具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等藥理活性。有報(bào)道顯示野黃芩苷可以通過(guò)ERK信號(hào)通路抑制心肌梗死所致的大鼠心肌纖維化,但其抗心肌纖維化相關(guān)的細(xì)胞及分子機(jī)制尚未完全明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),金...

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摘要
ABSTRACT
引言
第一章 Nur77在心肌纖維化組織及體外激活的原代心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況
    1.1 材料與儀器
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.1.4 細(xì)胞來(lái)源
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 ANGⅡ誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化模型建立
        1.2.2 原代心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
        1.2.3 組織石蠟包埋切片
        1.2.4 Masson’s trichrome染色檢測(cè)心肌組織膠原沉積
        1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá)
        1.2.6 免疫熒光檢測(cè)組織蛋白表達(dá)
        1.2.7 組織總RNA提取
        1.2.8 細(xì)胞總RNA提取
        1.2.9 逆轉(zhuǎn)錄
        1.2.10 RT-q PCR
        1.2.11 Western blot實(shí)驗(yàn)
        1.2.12 免疫熒光
        1.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 Nur77在小鼠纖維化心肌組織中的表達(dá)
        1.3.2 Nur77在體外原代心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況
    1.4 討論
    1.5 小結(jié)
第二章 調(diào)控Nur77對(duì)心肌成纖維細(xì)胞功能的影響
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 細(xì)胞來(lái)源
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 原代心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)
        2.2.2 293T細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.3 腺病毒Ad Nur77、Ad NC擴(kuò)增
        2.2.4 腺病毒感染原代心肌成纖維細(xì)胞
        2.2.5 si Nur77 RNA轉(zhuǎn)染原代心肌成纖維細(xì)胞
        2.2.6 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT-q PCR
        2.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)過(guò)表達(dá)Nur77對(duì)原代心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響
        2.2.9 CCK-8 法檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲減Nur77 對(duì)原代心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響
        2.2.10 劃痕法檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲減Nur77對(duì)原代心肌成纖維細(xì)胞遷移的影響
        2.2.11 Transwell法檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲減Nur77對(duì)原代心肌成纖維細(xì)胞遷移的影響
        2.2.12 細(xì)胞周期測(cè)定
        2.2.13 細(xì)胞凋亡測(cè)定
        2.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 過(guò)表達(dá)Nur77抑制原代心肌成纖維細(xì)胞增殖
        2.3.2 過(guò)表達(dá)Nur77抑制ANG Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)
        2.3.3 過(guò)表達(dá)Nur77抑制ANG Ⅱ誘導(dǎo)的原代心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和膠原合成
        2.3.4 過(guò)表達(dá)Nur77抑制ANG Ⅱ誘導(dǎo)的原代心肌成纖維細(xì)胞的遷移
        2.3.5 過(guò)表達(dá)Nur77對(duì)原代心肌成纖維細(xì)胞凋亡數(shù)無(wú)影響
        2.3.6 敲減Nur77促進(jìn)原代心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因表達(dá)
        2.3.7 敲減Nur77促進(jìn)原代心肌成纖維細(xì)胞的增殖
        2.3.8 敲減Nur77促進(jìn)原代心肌成纖維細(xì)胞的遷移
        2.3.9 敲減Nur77改變?cè)募〕衫w維細(xì)胞周期
        2.3.10 敲減Nur77抑制原代心肌成纖維細(xì)胞凋亡
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 野黃芩苷調(diào)控Nur77對(duì)心肌成纖維細(xì)胞功能影響及相關(guān)機(jī)制研究
    3.1 材料與儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.3 細(xì)胞來(lái)源
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 原代心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)
        3.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染原代心肌成纖維細(xì)胞
        3.2.3 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄
        3.2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)
        3.2.8 細(xì)胞免疫熒光
        3.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 野黃芩苷調(diào)控Nur77抑制原代心肌成纖維細(xì)胞的增殖
        3.3.2 野黃芩苷調(diào)控Nur77抑制原代心肌成纖維細(xì)胞的遷移
        3.3.3 野黃芩苷調(diào)控Nur77抑制原代心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)
        3.3.4 野黃芩苷調(diào)控Nur77抑制原代心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化
        3.3.5 野黃芩苷對(duì)原代心肌成纖維細(xì)胞中Nur77及其磷酸化蛋白表達(dá)的調(diào)控
        3.3.6 野黃芩苷通過(guò)ERK1/2/p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)控Nur77 及其磷酸化蛋白表達(dá)
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 野黃芩苷調(diào)控Nur77抑制ANG Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化
    4.1 .實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 小鼠心肌纖維化動(dòng)物模型的制備
        4.2.2 Masson’s trichrome染色
        4.2.3 HE染色
        4.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá)
        4.2.5 組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和RT-q PCR
        4.2.6 膠原面積半定量分析
        4.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)
        4.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 野黃芩苷調(diào)控Nur77 抑制ANG Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌組織中膠原沉積
        4.3.2 膠原染色面積測(cè)定
        4.3.3 野黃芩苷調(diào)控Nur77 抑制ANG Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化相關(guān)基因表達(dá)
        4.3.4 野黃芩苷調(diào)控Nur77 及其磷酸化蛋白抑制ANG Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化
        4.3.5 野黃芩苷對(duì)ANGⅡ激活的纖維化心肌組織中相關(guān)信號(hào)通路的影響
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄一 綜述 心肌纖維化發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)藥防治研究進(jìn)展
        參考文獻(xiàn)
    附錄二 在校期間發(fā)表文章
附件



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