乳腺癌是女性最高發(fā)的癌癥類型。GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員在發(fā)育和癌癥中都起著重要作用。典型的GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員GATA1-6參與誘導(dǎo)胚胎干細胞的分化和調(diào)節(jié)腫瘤干細胞功能。轉(zhuǎn)錄抑制因子GATA結(jié)合蛋白1(TRPS1)是非典型的GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員,TRPS1能夠抑制軟骨細胞促分化過程,暗示TRPS1在腫瘤干細胞中發(fā)揮重要作用,然而TRPS1是如何調(diào)控腫瘤細胞干性維持和腫瘤發(fā)生起始過程還不清楚。腫瘤干細胞在癌癥中廣泛分布并在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。SOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員SOX2是腫瘤干細胞干性維持和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。SOX2在乳腺癌的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過程中均發(fā)生重要作用,然而SOX2基因表達被如何調(diào)控尚未被揭示。TRPS1是非典型的GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員,通常作為轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)控靶基因的表達。本論文研究利用生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)TRPS1為潛在的調(diào)控SOX2表達的因子,進一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀和熒光素酶報告實驗等結(jié)果證實TRPS1能夠直接結(jié)合在SOX2的啟動子區(qū)域并且抑制啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。在體外細胞水平的實驗中,通過體外反映細胞干性的經(jīng)典實驗?zāi)Ｐ臀⑶蝮w實...

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表
緒論
第一章 文獻綜述
    1.1 乳腺癌的研究進展
        1.1.1 乳腺癌是一種高發(fā)的惡性腫瘤
        1.1.2 乳腺癌的分子分型
        1.1.3 乳腺癌的臨床分期
        1.1.4 乳腺癌的診療現(xiàn)狀和面臨的挑戰(zhàn)
    1.2 乳腺癌轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究進展
        1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子在乳腺癌中發(fā)揮調(diào)控作用的研究進展
        1.2.2 非編碼RNA在乳腺癌中發(fā)揮調(diào)控作用的研究進展
    1.3 GATA家族成員在乳腺癌中的研究進展
        1.3.1 GATA家族概述
        1.3.2 GATA家族經(jīng)典成員的生物學(xué)功能
        1.3.3 GATA家族經(jīng)典成員在乳腺癌中的研究進展
        1.3.4 非典型GATA家族成員TRPS1 的生物學(xué)功能
        1.3.5 TRPS1 在乳腺癌中的研究進展
    1.4 SOX2 的研究進展
        1.4.1 SOX基因家族概述
        1.4.2 SOX2 概述和生物學(xué)功能
        1.4.3 SOX2 在乳腺癌中的研究進展
    1.5 乳腺癌干細胞研究進展
        1.5.1 干細胞概述
        1.5.2 腫瘤干細胞概述
        1.5.3 乳腺癌干細胞概述
第二章 實驗材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 細胞系
        2.1.2 小干擾RNA
        2.1.3 質(zhì)粒
    2.2 實驗試劑
        2.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
        2.2.2 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR相關(guān)試劑
        2.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡相關(guān)試劑
        2.2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀相關(guān)試劑
        2.2.5 熒光素酶報告實驗相關(guān)試劑盒
        2.2.6 微球體實驗
        2.2.7 流式細胞分析和分選
        2.2.8 裸鼠成瘤實驗
        2.2.9 生化、分子實驗試劑
    2.3 常用溶液配方
    2.4 實驗耗材和儀器
        2.4.1 實驗耗材
        2.4.2 實驗儀器
    2.5 實驗方法
        2.5.1 細胞培養(yǎng)
            2.5.1.1 細胞復(fù)蘇
            2.5.1.2 細胞傳代
            2.5.1.3 細胞凍存
        2.5.2 siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞
        2.5.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞
        2.5.4 乳腺癌細胞總RNA的提取
        2.5.5 RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA
        2.5.6 實時熒光定量PCR
        2.5.7 蛋白質(zhì)免疫印跡
            2.5.7.1 腫瘤細胞內(nèi)總蛋白的提取和制備
            2.5.7.2 蛋白樣品定量
            2.5.7.3 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.5.7.4 轉(zhuǎn)膜與封閉
            2.5.7.5 抗體孵育與顯色
        2.5.8 質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.5.8.1 感受態(tài)細胞的制備
            2.5.8.2 目的片段的擴增
            2.5.8.3 目的片段與質(zhì)粒載體的酶切反應(yīng)
            2.5.8.4 目的片段與質(zhì)粒載體的連接
            2.5.8.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.5.9 定點突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.5.10 慢病毒包裝系統(tǒng)
        2.5.11 染色質(zhì)免疫共沉淀
        2.5.12 熒光素酶報告實驗
        2.5.13 微球體實驗
        2.5.14 流式細胞分析和分選
        2.5.15 裸鼠成瘤實驗
        2.5.16 臨床樣本分析
        2.5.17 統(tǒng)計分析
第三章 實驗結(jié)果及討論
    引言
    3.1 TRPS1 抑制SOX2 的表達
        3.1.1 從數(shù)據(jù)庫中挖掘調(diào)控SOX2 的轉(zhuǎn)錄因子TRPS
        3.1.2 T47D和 MCF7中TRPS1 抑制SOX2 的表達
    3.2 TRPS1 錨定在SOX2 的啟動子區(qū)域并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用
        3.2.1 TRPS1 直接結(jié)合在SOX2 的啟動子區(qū)域
        3.2.2 TRPS1對SOX2 的啟動子區(qū)域發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用
        3.2.3 小結(jié)
    3.3 在體外TRPS1 通過抑制SOX2 的表達抑制腫瘤細胞干性
        3.3.1 TRPS1 通過SOX2 實現(xiàn)對乳腺癌細胞干性調(diào)控
        3.3.2 構(gòu)建MCF7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系
        3.3.3 TRPS1 調(diào)控乳腺癌細胞的成球能力
        3.3.4 TRPS1 調(diào)控腫瘤細胞中CD44+/CD24-細胞群體
        3.3.5 乳腺癌患者樣本中TRPS1和SOX2 表達情況
        3.3.6 小結(jié)
    3.4 在裸鼠體內(nèi)TRPS1 通過抑制SOX2 的表達抑制腫瘤發(fā)生的起始過程
        3.4.1 TRPS1 對腫瘤發(fā)生階段的影響
        3.4.2 TRPS1 對腫瘤生長階段的影響
        3.4.3 小結(jié)
    3.5 討論
結(jié)論與展望
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3769852