目的:觀察肝臟自然殺傷細胞在乙肝肝硬化及肝癌臨床肝組織樣本中的表型變化特點,尋找乙肝肝硬化及肝癌中肝內(nèi)NK細胞的相關(guān)病理分子;體內(nèi)動物實驗比較分析中藥扶正化瘀方聯(lián)合抗病毒藥物恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝臟自然殺傷細胞的免疫調(diào)控作用,進一步體內(nèi)清除NK細胞后,觀察聯(lián)合用藥方案對抗乙肝背景肝纖維化藥效的影響;體外探討說明中藥扶正化瘀方通過提高NK細胞對HSC的識別殺傷活性,抑制HSC活化的抗肝纖維化的免疫調(diào)控機制。本論文分為四個部分。方法:1、收集2017年11月至2018年10月期間在上海交通大學(xué)附屬仁濟醫(yī)院肝移植中心行外科手術(shù)住院患者的肝組織樣本以及術(shù)前臨床基線資料,HE及天狼猩紅病理染色觀察肝組織炎癥及纖維化程度,采用流式細胞術(shù)檢測各肝組織樣本中NK細胞的數(shù)量、亞型以及表面激活型受體NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46的表達,Pearson相關(guān)性分析探索NK細胞數(shù)量、亞型及表面激活型受體的表達與相應(yīng)臨床基線資料實驗室指標之間的相關(guān)性,以及其與肝纖維化天狼猩紅染色面積參數(shù)的相關(guān)性,通過免疫組化雙重染色技術(shù)對激活型NK細胞與活化HSC進行共定位,觀察不同組別的共表達差異。2...

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學(xué)位級別】：博士

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主要縮略語
中文摘要
ABSTRACT
引言
第一部分 肝臟自然殺傷細胞在乙肝肝硬化及肝癌組織中的表型變化特點
    1 研究對象
        1.1 病例來源
        1.2 納入標準
        1.3 排除標準
        1.4 分組
    2 觀察指標
        2.1 實驗室檢查
        2.2 肝組織病理檢查
        2.3 肝內(nèi)NK細胞亞型及激活型受體檢測
    3 材料
        3.1 主要試劑
        3.2 主要儀器設(shè)備
    4 方法
        4.1 組織樣本的處理
        4.2 肝組織病理染色
        4.3 肝內(nèi)NK細胞亞型及表面激活型受體檢測
        4.4 石蠟切片免疫組化雙重染色
        4.5 統(tǒng)計分析
    5 結(jié)果
        5.1 基本資料
        5.2 肝組織病理學(xué)觀察
        5.3 肝內(nèi)NK細胞亞型及表面激活型受體的表達特點
        5.4 肝內(nèi)NK細胞數(shù)量、亞型與臨床基本資料的相關(guān)性分析
        5.5 肝內(nèi)NK細胞表面激活型受體與臨床基本資料的相關(guān)性分析
        5.6 肝內(nèi)NK細胞表面激活型受體NKG2D的表達與纖維化面積相關(guān)性分析
        5.7 肝組織免疫組化雙重染色觀察肝內(nèi)NK細胞與活化肝星狀細胞的關(guān)系
    6 分析與討論
第二部分 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝臟自然殺傷細胞的免疫調(diào)控作用
    1 材料
        1.1 實驗動物
        1.2 藥物
        1.3 試劑
        1.4 主要儀器設(shè)備
    2 方法
        2.1 實驗分組、造模及藥物干預(yù)
        2.2 樣品的采集與處理
        2.3 血清病毒學(xué)檢測
        2.4 血清肝功能檢測
        2.5 肝組織病理染色
        2.6 肝組織羥脯氨酸含量測定
        2.7 石蠟切片免疫組化染色
        2.8 Western Blot蛋白免疫印跡雜交
        2.9 流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子
        2.10 肝組織免疫熒光
        2.11 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠體重及臟器指數(shù)的影響
        3.2 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠病毒學(xué)指標的影響
        3.3 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠血清肝功能的影響
        3.4 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織炎癥病理的影響
        3.5 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織膠原沉積的影響
        3.6 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織羥脯氨酸含量的影響
        3.7 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織α-SMA及I型膠原表達的影響
        3.8 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝內(nèi)淋巴細胞分群的影響
        3.9 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝內(nèi)NK細胞表面激活型受體NKG2D表達的影響
        3.10 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織RAE-1和Desmin表達的影響
        3.11 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織RAE-1和α-SMA表達的影響
    4 分析與討論
第三部分 體內(nèi)清除自然殺傷細胞對扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋抗乙肝背景小鼠肝纖維化藥效的影響
    1 材料
        1.1 實驗動物
        1.2 藥物
        1.3 主要試劑及儀器設(shè)備
    2 方法
        2.1 實驗分組、造模及藥物干預(yù)
        2.2 樣品的采集與處理
        2.3 血清病毒學(xué)及肝功能生化檢測
        2.4 肝組織病理染色
        2.5 肝組織羥脯氨酸含量測定
        2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子
        2.7 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 體內(nèi)清除自然殺傷細胞后扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠體重及臟器指數(shù)的影響
        3.2 扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對Anti-ASGM1清除乙肝背景肝纖維化小鼠肝內(nèi)NK細胞的拮抗作用
        3.3 體內(nèi)清除自然殺傷細胞后扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠血清病毒學(xué)指標的影響
        3.4 體內(nèi)清除自然殺傷細胞后扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠血清肝功能的影響
        3.5 體內(nèi)清除自然殺傷細胞后扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織炎癥病理的影響
        3.6 體內(nèi)清除自然殺傷細胞后扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織膠原沉積的影響
        3.7 體內(nèi)清除自然殺傷細胞后扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋對乙肝背景肝纖維化小鼠肝組織羥脯氨酸含量的影響
        3.8 Anti-ASGM1清除乙肝背景肝纖維化小鼠肝內(nèi)NK細胞后肝內(nèi)主要淋巴細胞亞群的變化及扶正化瘀方聯(lián)合恩替卡韋的干預(yù)作用
    4 分析與討論
第四部分 扶正化瘀方體外調(diào)節(jié)自然殺傷細胞功能的抗肝纖維化作用機制
    1 材料
        1.1 細胞株
        1.2 藥物
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器設(shè)備
    2 方法
        2.1 細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)與凍存
        2.2 藥物配制
        2.3 藥物對細胞的毒性測定
        2.4 Annexin V/7-AAD復(fù)染法檢測細胞凋亡
        2.5 熒光定量PCR檢測mRNA表達
        2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子
        2.7 ELISA檢測細胞因子分泌水平
        2.8 NK92與CFSE-K562細胞共培養(yǎng)殺傷體系的建立及藥物評價
        2.9 藥物預(yù)孵育的NK92與LX-2共培養(yǎng)
        2.10 細胞免疫熒光檢測
        2.11 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 扶正化瘀方對NK92細胞株和LX-2細胞株的毒性測定
        3.2 扶正化瘀方對NK92細胞株凋亡的影響
        3.3 扶正化瘀方對NK92細胞表面激活型受體表達的影響
        3.4 扶正化瘀方對NK92細胞分泌IFN-γ和Granzyme B水平的影響
        3.5 扶正化瘀方對NK92細胞株殺傷K562功能的影響
        3.6 扶正化瘀方預(yù)孵育的NK92與LX-2共培養(yǎng)后NK92細胞表面激活型受體NKG2D的表達變化
        3.7 扶正化瘀方預(yù)孵育的NK92與LX-2共培養(yǎng)后LX-2細胞表面配體RAE-1的表達變化
        3.8 扶正化瘀方預(yù)孵育的NK92與LX-2共培養(yǎng)后LX-2細胞活化情況
    4 分析與討論
創(chuàng)新點
結(jié)論
致謝
參考文獻
附錄
    附錄1 :文獻綜述 基于肝臟免疫微環(huán)境探討中西醫(yī)結(jié)合有效逆轉(zhuǎn)乙肝肝纖維化的目標人群特征和作用機制
        參考文獻
    附錄2 :在校期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文
        在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文1(首頁)
        在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文2(首頁)
        在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文3(首頁)
        在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文4(首頁)
        在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文5(摘要)
        在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文6(Abstract)
        在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文7(Abstract)
    附錄3 :參加學(xué)術(shù)會議及獲獎情況



本文編號：3749779