第一部分UPEC誘導大鼠睪丸巨噬細胞分泌PK2【目的】探究PK2在UPEC誘導的睪丸炎中,在巨噬細胞上的定位及表達情況�！痉椒ā繕嫿║PEC大鼠睪丸炎模型:將細菌懸液由雙側輸精管逆行注射,同時用相同方法注入等體積的生理鹽水設置對照組。各組大鼠建模7天后,對睪丸進行UPEC基因Pap C及菌落鑒定以確認建模是否成功。電鏡檢測UPEC在睪丸中的定位情況。分離睪丸巨噬細胞,對細胞內PK2的表達情況進行定位及定量的分析,同時用ELISA檢測間質液及細胞培養(yǎng)上清中PK2的表達水平�！窘Y果】各組大鼠處理7天后,感染組睪丸體積較對照組縮小,質量減輕,組織切片內可見生精小管上皮變薄,間質中大量巨噬細胞浸潤,精子數(shù)量及前向運動率均降低。Pap C基因在對照組中無表達,但可表達于感染組睪丸中。感染組睪丸間質液涂布于平板,次日可見平板上菌落生長,而對照組間質液涂布的平板上無菌落生長。電鏡結果顯示,對照組大鼠睪丸間質部充盈著豐富的間質液且巨噬細胞數(shù)量較少,而感染組的間質中可見大量巨噬細胞浸潤,且可觀察到UPEC侵入間質區(qū)域。免疫熒光結果顯示,在對照組中,PK2主要在巨噬細胞的細胞核內表達,而在感染組中,PK2...

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
前言
摘要
ABSTRACT
第一部分 UPEC誘導大鼠睪丸巨噬細胞分泌PK2
    1 前言
    2 材料(對象)與方法
        2.1 主要儀器及試劑
            2.1.1 主要儀器
            2.1.2 主要試劑
        2.2 實驗對象及分組
            2.2.1 實驗動物
            2.2.2 實驗分組
            2.2.3 標本取材
        2.3 主要實驗方法
            2.3.1 細菌培養(yǎng)與定量
            2.3.2 UPEC誘導的大鼠睪丸炎模型鑒定
            2.3.3 睪丸組織形態(tài)學HE染色
            2.3.4 精液檢測
            2.3.5 QRT-PCR檢測睪丸巨噬細胞內PK2的MRNA表達水平
            2.3.6 Western blot檢測巨噬細胞及上清中PK2 蛋白表達水平
            2.3.7 ELISA檢測上清及間質液中PK2 濃度
            2.3.8 免疫熒光檢測PK2 在睪丸巨噬細胞內定位情況
            2.3.9 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 UPEC睪丸炎大鼠模型鑒定
            3.1.1 大鼠睪丸外觀及質量變化
            3.1.2 大鼠睪丸組織學變化情況
            3.1.3 精子質量變化情況
            3.1.4 睪丸組織內UPEC基因鑒定
            3.1.5 睪丸間質液內UPEC鑒定
            3.1.6 UPEC在睪丸內的定位情況
        3.2 PK2 在睪丸巨噬細胞中的表達情況
            3.2.1 PK2 在睪丸巨噬細胞中的定位情況
            3.2.2 PK2 在各組大鼠睪丸巨噬細胞及培養(yǎng)上清的表達情況
        3.3 大鼠睪丸巨噬細胞培養(yǎng)上清及睪丸間質液中PK2 的分泌情況
            3.3.1 體內實驗中各組大鼠細胞上清及間質液中PK2 分泌情況
            3.3.2 UPEC體外刺激巨噬細胞分泌PK2 情況
    4 討論
    5 實驗小結
第二部分 PKR-A抑制UPEC誘導的睪丸炎性損傷
    1 前言
    2 材料(對象)與方法
        2.1 主要儀器與試劑
            2.1.1 主要儀器
            2.1.2 主要試劑
        2.2 實驗對象及分組
            2.2.1 PKR-A配制
            2.2.2 實驗動物及分組
        2.3 主要實驗方法
            2.3.1 睪丸組織形態(tài)學 HE 染色(同第一部分 2.3.3)
            2.3.2 精液檢測(同第一部分 2.3.4)
            2.3.3 血清睪酮水平檢測
            2.3.4 流式細胞術檢測睪丸巨噬細胞亞型比例
            2.3.5 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 睪丸組織形態(tài)學HE染色
        3.2 精液常規(guī)
        3.3 血清睪酮水平
        3.4 睪丸巨噬細胞亞型比例變化情況
    4 討論
    5 實驗小結
第三部分 PK2 通過促進NLRP3 通路活化促進IL-1β分泌
    1 前言
    2 材料(對象)與方法
        2.1 主要儀器及試劑
            2.1.1 主要儀器
            2.1.2 主要試劑
        2.2 體內實驗分組
        2.3 睪丸原代巨噬細胞的分離培養(yǎng)及體外感染/干預模型的構建
            2.3.1 細胞體外感染模型
            2.3.2 PK2 體外干預方法
        2.4 主要實驗方法
            2.4.1 ELISA檢測睪丸間質液及細胞培養(yǎng)上清中的IL-1β
            2.4.2 Caspase-1 活性檢測試劑盒檢測細胞內caspase-1 活性的表達
            2.4.3 Western blot檢測NLRP3 通路相關因子在不同處理后的變化
            2.4.4 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 體內實驗
            3.1.1 感染及干預后睪丸間質液中IL-1β的表達變化
            3.1.2 感染及干預后睪丸巨噬細胞caspase-1 活性水平
            3.1.3 感染及干預后睪丸巨噬細胞NLRP3 通路相關因子的表達情況
        3.2 體外實驗
            3.2.1 UPEC及外源性PK2 對巨噬細胞分泌IL-1β的影響
            3.2.2 UPEC 及外源性 PK2 對巨噬細胞表達 NLRP3 和 caspase-1 的影響
            3.2.3 NLRP3及caspase-1 抑制劑對睪丸巨噬細胞分泌IL-1β的影響
            3.2.4 NLRP3及caspase-1 抑制劑對巨噬細胞表達NLRP3和caspase-1 的影響
    4 討論
    5 實驗小結
第四部分 睪丸巨噬細胞釋放IL-1β抑制睪酮合成
    1 前言
    2 材料(對象)與方法
        2.1 主要儀器及試劑
            2.1.1 主要儀器
            2.1.2 主要試劑
        2.2 實驗對象及分組
            2.2.1 原代睪丸間質細胞的分離與培養(yǎng)
            2.2.2 實驗分組
        2.3 主要實驗方法
            2.3.1 CCK8 試劑盒檢測細胞活性
            2.3.2 化學發(fā)光法檢測間質細胞培養(yǎng)上清中睪酮濃度(同第一部分 2.3.5)
            2.3.3 qRT-PCR 檢測間質細胞內睪酮合成相關酶基因表達(同第一部分2.3.6)
            2.3.4 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 間質細胞的細胞活性
            3.1.1 不同濃度IL-1β對間質細胞活性的影響
            3.1.2 不同處理的巨噬細胞培養(yǎng)上清對間質細胞活性的影響
        3.2 間質細胞培養(yǎng)上清中睪酮濃度
            3.2.1 不同濃度IL-1β對間質細胞分泌睪酮的影響
            3.2.2 不同處理的巨噬細胞培養(yǎng)上清對間質細胞分泌睪酮的影響
        3.3 間質細胞中睪酮合成相關酶的基因表達情況
            3.3.1 不同濃度IL-1β對間質細胞中睪酮合成相關酶基因表達的影響
            3.3.2 不同處理的巨噬細胞培養(yǎng)上清對間質細胞中睪酮合成相關酶基因表達的影響
    4 討論
    5 實驗小結
全文總結
致謝
參考文獻
綜述
    參考文獻
附錄1 攻讀博士學位期間發(fā)表論文情況
附錄2 主要英文縮略詞一覽表



本文編號：3749506