背景與目的:結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)和肝癌(Hepatocellular cancer,HCC)是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤,在中國(guó)發(fā)病率和死亡率均很高。膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)在多種腫瘤組織高表達(dá),促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展特質(zhì)如癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移強(qiáng)化等。研究發(fā)現(xiàn)ANXA2也在CRC和HCC中高表達(dá),ANXA2在CRC的發(fā)展過(guò)程中可能是一個(gè)關(guān)鍵性基因表達(dá)異化事件之一,而且可能存在一條ANXA2信號(hào)通路。ANXA2在29.5%的被調(diào)查CRC病例中高表達(dá),并且與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移侵襲等密切相關(guān)。ANXA2活化是其發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的基礎(chǔ),文獻(xiàn)表明ANXA2活化的重要功能域位于其N末端,但是,其N端關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制報(bào)道極少。進(jìn)一步深入研究ANXA2蛋白N端關(guān)鍵位點(diǎn)對(duì)理解其信號(hào)通路調(diào)節(jié)及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系具有重要意義。在前期構(gòu)建的ANXA2人結(jié)直腸癌敲除細(xì)胞系(ANXA2-/-caco2)的基礎(chǔ)之上,我們以單點(diǎn)突變(Site directed mutation)和多點(diǎn)突變(Multiple sites directed ...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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摘要
Abstract
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第1章 緒論
    1.1 結(jié)直腸癌及其研究現(xiàn)狀
        1.1.1 結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)病率
        1.1.2 結(jié)直腸癌的診斷、治療
    1.2 ANXA家族及ANXA2
        1.2.1 ANXA家族
        1.2.2 ANXA2與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系
        1.2.3 ANXA2關(guān)鍵位點(diǎn)及其信號(hào)通路激活
    1.3 肝癌的靶向治療
        1.3.1 阿霉素藥物研究現(xiàn)狀
        1.3.2 肝癌靶向多肽研究現(xiàn)狀
    1.4 miRNA與肝癌
        1.4.1 miRNA概述
        1.4.2 肝癌有關(guān)miRNAs的研究進(jìn)展
        1.4.3 肝癌MDR相關(guān)miRNAs的研究動(dòng)態(tài)
    1.5 選題依據(jù)與研究思路
        1.5.1 ANXA2在結(jié)直腸癌中的分子構(gòu)效與調(diào)控研究
        1.5.2 肝癌靶向藥物遞送體系研究
第2章 ANXA2與結(jié)直腸癌和肝癌惡性程度的關(guān)系
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 試劑的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 ANXA2在腫瘤臨床樣本中的變異
        2.2.2 ANXA2在CRC和HCC臨床樣本中的變異
        2.2.3 ANXA2在CRC和HCC臨床發(fā)展中的作用分析
        2.2.4 石蠟片免疫熒光染色
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 ANXA2在腫瘤臨床樣本中的變異
        2.3.2 ANXA2在CRC和HCC臨床樣本中的變異
        2.3.3 ANXA2增強(qiáng)CRC和HCC發(fā)展
        2.3.4 ANXA2在結(jié)腸癌和肝癌臨床組織的表達(dá)
        2.3.5 ANXA2在結(jié)腸癌和肝癌組織芯片的表達(dá)
        2.3.6 ANXA2表達(dá)與結(jié)腸癌和肝癌惡性程度相關(guān)分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第3章 ANXA2 N端關(guān)鍵位點(diǎn)在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.1.4 試劑的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 ANXA2 N端點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 ANXA2 N端點(diǎn)突變PCR反應(yīng)
        3.2.3 質(zhì)粒濃度與純度測(cè)定
        3.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.6 Western Blot
        3.2.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖
        3.2.8 細(xì)胞周期檢測(cè)
        3.2.9 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及遷移能力檢測(cè)
        3.2.10 細(xì)胞F-actin檢測(cè)
        3.2.11 細(xì)胞β-tubulin檢測(cè)
        3.2.12 細(xì)胞骨架整體形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè)
        3.2.13 掃描電子顯微鏡檢測(cè)
        3.2.14 透射電子顯微鏡檢測(cè)
        3.2.15 統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 陽(yáng)性克隆的制備和檢測(cè)
        3.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率評(píng)估
        3.3.3 Western Blot檢測(cè)ANXA2 N端各突變點(diǎn)磷酸化水平
        3.3.4 ANXA2 N端點(diǎn)突變對(duì)caco2細(xì)胞增殖的影響
        3.3.5 ANXA2 N端點(diǎn)突變對(duì)caco2細(xì)胞周期的影響
        3.3.6 ANXA2 N端點(diǎn)突變對(duì)caco2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及遷移能力的影響
        3.3.7 ANXA2 N端點(diǎn)突變對(duì)caco2細(xì)胞F-actin和β-tubulin聚合的影響
        3.3.8 ANXA2 N端點(diǎn)突變對(duì)caco2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)微結(jié)構(gòu)的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第4章 miR-206對(duì)ANXA2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 主要儀器設(shè)備(同第3章)
        4.1.4 試劑的配制(同第3章)
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 靶向ANXA2的miRNAs預(yù)測(cè)
        4.2.2 miRNA前體基因DNA插入片段設(shè)計(jì)
        4.2.3 pcDNA6.2-GW和pmirGLO質(zhì)粒載體小量制備
        4.2.4 pcDNA6.2-GW質(zhì)粒載體膠純化回收
        4.2.5 pre-miRNA雙鏈形成
        4.2.6 pcDNA6.2-GW/miRNA質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.7 ANXA2的3'UTR設(shè)計(jì)與合成
        4.2.8 ANXA2 3'UTR雙熒光素報(bào)告基因載體的構(gòu)建
        4.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)
        4.2.10 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)
        4.2.11 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及遷移能力、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞骨架整體形態(tài)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)
        4.2.12 EMT相關(guān)基因Western Blot檢測(cè)
        4.2.13 統(tǒng)計(jì)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 靶向ANXA2的miRNAs預(yù)測(cè)
        4.3.2 陽(yáng)性克隆的鑒定和制備
        4.3.3 miR-206、miR-1-3p和miR-613與ANXA2 3'UTR靶向關(guān)系驗(yàn)證
        4.3.4 miR-206抑制ANXA2蛋白水平的表達(dá)
        4.3.5 過(guò)表達(dá)miR-206抑制caco2細(xì)胞增殖
        4.3.6 過(guò)表達(dá)miR-206對(duì)caco2細(xì)胞周期的影響
        4.3.7 過(guò)表達(dá)miR-206抑制caco2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)
        4.3.8 過(guò)表達(dá)miR-206對(duì)caco2細(xì)胞凋亡的影響
        4.3.9 過(guò)表達(dá)miR-206對(duì)caco2細(xì)胞骨架整體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
        4.3.10 過(guò)表達(dá)miR-206抑制caco2細(xì)胞EMT的發(fā)生
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第5章 肝癌靶向藥物遞送體系的構(gòu)建及其對(duì)ANXA2和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
        5.1.4 試劑的配制
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 miRNA的選擇
        5.2.2 miR-101種子區(qū)與MDR關(guān)鍵基因3,UTR的靶點(diǎn)分析
        5.2.3 miR-101前體基因DNA插入片段設(shè)計(jì)
        5.2.4 pcDNA6.2-GW質(zhì)粒載體小量制備、膠純化回收、pre-miR-101雙鏈的形成、pcDNA6.2-GW/miR-101質(zhì)粒的構(gòu)建及小量制備
        5.2.5 PEG與多肽反應(yīng)
        5.2.6 多肽靶向陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備
        5.2.7 載DOX
        5.2.8 載DNA
        5.2.9 HCSP4-Lipo-DOX-miR101粒徑、分散系數(shù)以及包封率檢測(cè)
        5.2.10 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的微結(jié)構(gòu)觀察
        5.2.11 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的靶向性檢測(cè)
        5.2.12 裸鼠分組
        5.2.13 細(xì)胞接種
        5.2.14 藥物注射
        5.2.15 動(dòng)物處死及解剖
        5.2.16 統(tǒng)計(jì)分析
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 ANXA2與miR-101的靶向關(guān)系分析
        5.3.2 miR-101與MDR相關(guān)基因的靶點(diǎn)分析
        5.3.3 pcDNA6.2-GW/miR-101陽(yáng)性克隆的鑒定和制備
        5.3.4 HCSP4-Lipo-DOX-miR101粒徑、分散系數(shù)以及藥物包封率檢測(cè)
        5.3.5 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的微觀形態(tài)觀察
        5.3.6 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率評(píng)估
        5.3.7 HCSP4-Lipo-DOX-miR101的靶向性檢測(cè)
        5.3.8 HCSP4-Lipo-DOX-miR101對(duì)肝癌細(xì)胞ANXA2蛋白水平的影響
        5.3.9 HCSP4-Lipo-DOX-miR101對(duì)裸鼠HCC移植瘤生長(zhǎng)的影響
        5.3.10 HCSP4-Lipo-DOX-miR101對(duì)裸鼠HCC移植瘤體積的影響
        5.3.11 HCSP4-Lipo-DOX-miR101對(duì)裸鼠HCC移植瘤重量的影響
        5.3.12 HCSP4-Lipo-DOX-miR101對(duì)裸鼠HCC移植瘤轉(zhuǎn)移力的影響
        5.3.13 ANXA2在裸鼠HCC移植瘤中的表達(dá)及作用分析
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第6章 全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀博士學(xué)位期間的科研成果



本文編號(hào)：3746754