淋巴細胞特異性酪氨酸蛋白激酶(Lck)在T細胞受體(TCR)信號通路啟動過程中起著非常重要的作用。在經(jīng)典的TCR信號轉(zhuǎn)導通路中,當TCR與配體結(jié)合而被激活時,最先被檢測到的分子事件即是激活的Lck磷酸化CD3-ζ鏈中的ITAM基序上的酪氨酸殘基。磷酸化的ITAM作為停泊位點招募Zap70激酶,隨后招募至此的Zap70激酶因被激活的Lck磷酸化而激活,參與TCR信號的轉(zhuǎn)導過程。但是,在這一信號轉(zhuǎn)導過程中,Lck蛋白激酶的動態(tài)激活調(diào)節(jié)機制還沒有得到很好的研究。Lck激酶活性的調(diào)節(jié)與其酪氨酸394和酪氨酸505殘基的磷酸化水平密切相關(guān)。通常認為酪氨酸505的磷酸化抑制了Lck的激酶活性,它的突變會造成Lck的持續(xù)激活。而酪氨酸394的磷酸化促進了Lck的激酶活性,它的突變則會導致Lck激酶活性喪失,但是也有一些研究小組持有不同的看法�？梢�,酪氨酸394殘基在調(diào)節(jié)Lck激酶活性中的功能作用是有爭議的。而且先前的研究報道對Lck激酶預激活狀態(tài)的存在也有爭議。通常用于研究Lck激酶活性調(diào)節(jié)的方法為生物化學方法,如Western Blot,這種經(jīng)典方法并不能有效地監(jiān)測活細胞中Lck激酶活性的動態(tài)變化...

【文章頁數(shù)】：148 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
主要縮略詞
1 緒論
    1.1 問題的提出與意義
    1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 TCR信號轉(zhuǎn)導中分子事件的研究現(xiàn)狀
        1.2.2 Lck結(jié)構(gòu)和功能的研究現(xiàn)狀
        1.2.3 熒光共振轉(zhuǎn)移原理在生物學研究中的應用
    1.3 研究目的以及研究內(nèi)容
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究內(nèi)容
2 新型LckFRET生物探針的構(gòu)建以及體外表征
    2.1 前言
    2.2 實驗儀器、材料與試劑
        2.2.1 實驗儀器
        2.2.2 實驗材料與試劑
        2.2.3 配制的溶液和試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 重組LckFRET生物探針質(zhì)粒和Src FRET生物探針質(zhì)粒的擴增
        2.3.2 LckFRET生物探針蛋白和Src FRET生物探針蛋白的誘導表達
        2.3.3 純化LckFRET生物探針蛋白和Src FRET生物探針蛋白
        2.3.4 體外激酶分析法
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 LckFRET生物探針蛋白的誘導表達和純化
        2.4.2 LckFRET生物探針在體外對激活的Src激酶的靈敏性
        2.4.3 Lck生物探針的FRET信號變化與探針分子空間構(gòu)象變化的關(guān)系
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
3 LckFRET生物探針的特異性底物肽的篩選
    3.1 前言
    3.2 實驗儀器、材料和試劑
        3.2.1 實驗儀器
        3.2.2 實驗材料與試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 Jurkat細胞培養(yǎng)
        3.3.2 293T細胞的培養(yǎng)
        3.3.3 pSIN-Zap Lck、pSIN-LckWT、pSIN-LckY394F和pSIN-LckK273R重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.4 慢病毒包裝
        3.3.5 慢病毒收集
        3.3.6 慢病毒轉(zhuǎn)染細胞
        3.3.7 電轉(zhuǎn)染(Electroporation)
        3.3.8 CD3/CD28抗體復合物的配制
        3.3.9 活細胞成像實驗
        3.3.10 IP/IB(免疫沉淀和免疫印跡)
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 重組質(zhì)粒pSIN-Zap Lck、pSIN-LckWT、pSIN-LckY394F和pSIN-LckK273R的構(gòu)建
        3.4.2 Jurkat細胞中Lck-FRET-Zap70FY生物探針對Lck激酶活性的監(jiān)測
        3.4.3 Lck-FRET-Zap70FY生物探針對Lck激酶活性監(jiān)測的特異性
        3.4.4 T細胞中LckY394F激酶活性檢測
        3.4.5 內(nèi)源性Zap70對Zap Lck生物探針底物肽磷酸化的影響
        3.4.6 Fyn FRET生物探針對T細胞中Fyn激酶的活性監(jiān)測
    3.5 本章討論
    3.6 本章小結(jié)
4 Lck激酶在T細胞中的預先激活評估
    4.1 前言
    4.2 實驗儀器、材料與試劑
        4.2.1 實驗儀器
        4.2.2 實驗材料與試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 PBMC細胞分離與培養(yǎng)
        4.3.2 重組質(zhì)粒pSIN-LckWT-mCherry和pSIN-LckY394F-mCherry的構(gòu)建
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 Jurkat細胞中內(nèi)源性LckWT激酶的預先激活評估
        4.4.2 PBMC細胞中Lck激酶預先激活部分的評估
        4.4.3 重組質(zhì)粒pSIN-LckWT-mCherry和pSIN-LckY394F-mCherry的構(gòu)建
        4.4.4 LckWT和LckY394F在T細胞中的分布
    4.5 本章討論
    4.6 本章小結(jié)
5 Lck激酶介導ERK激酶的快速激活
    5.1 前言
    5.2 實驗儀器、材料與試劑
        5.2.1 實驗儀器
        5.2.2 實驗材料與試劑
    5.3 實驗方法
        5.3.1 pcDNA3.1-ERK FRET生物探針質(zhì)粒的擴增
        5.3.2 Western Blot
        5.3.3 活細胞成像實驗
    5.4 實驗結(jié)果
        5.4.1 LckY394F轉(zhuǎn)導TCR信號至下游分子ERK
        5.4.2 ERK蛋白水平的磷酸化
        5.4.3 PP1預處理對LckY394F介導的ERK激酶的快速激活的影響
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
6 T細胞共受體CD3和CD28在Lck激活中的重要作用
    6.1 前言
    6.2 實驗儀器、材料與試劑
        6.2.1 實驗儀器
        6.2.2 實驗材料與試劑
    6.3 實驗方法
        6.3.1 抗體復合物的配制
        6.3.2 活細胞成像實驗
    6.4 實驗結(jié)果
        6.4.1 不同濃度CD3/CD28抗體復合物刺激對Lck激酶激活的影響
        6.4.2 不同濃度CD3受體-抗體結(jié)合對Lck激酶激活的影響
        6.4.3 CD28受體-抗體結(jié)合對Lck激酶激活的影響
    6.5 本章討論
    6.6 本章小結(jié)
7 LckWT和LckY394F表達水平與其激酶活性之間的關(guān)系
    7.1 前言
    7.2 實驗儀器、材料與試劑
        7.2.1 實驗儀器
        7.2.2 實驗材料與試劑
    7.3 實驗方法
        7.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        7.3.2 慢病毒包裝
        7.3.3 抗體復合物的配制
        7.3.4 活細胞成像實驗
    7.4 實驗結(jié)果
        7.4.1 重組質(zhì)粒pSIN-LckK273R-mCherry的構(gòu)建
        7.4.2 Lck表達水平與其基礎活性之間的關(guān)系
        7.4.3 Lck表達水平對其激酶激活動力學的影響
    7.5 本章討論
    7.6 本章小結(jié)
8 LckWT和LckY394F不同的激酶調(diào)節(jié)模式
    8.1 前言
    8.2 實驗儀器、材料與試劑
        8.2.1 實驗儀器
        8.2.2 實驗材料與試劑
    8.3 實驗方法
        8.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        8.3.2 熒光漂白與恢復實驗
        8.3.3 BiFC-splitVenus體系活細胞成像實驗
    8.4 實驗結(jié)果
        8.4.1 Lck在T細胞中的擴散速率
        8.4.2 Lck-Bi FC-split-Venus體系相關(guān)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        8.4.3 細胞中Lck激酶分子間的相互作用
    8.5 本章討論
    8.6 本章小結(jié)
9 結(jié)論、不足與展望
    9.1 主要結(jié)論
    9.2 工作不足之處
    9.3 工作展望
參考文獻
附錄
    A 作者在攻讀博士學位期間發(fā)表論文及專利情況
        論文
        專利
    B 學位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號：3746321