肝癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一,我國肝癌發(fā)病率居全球之首,每年新發(fā)病例和死亡患者約占全球總數(shù)的一半。目前肝癌患者的5年生存率僅為15%,因此迫切需要加強肝癌的發(fā)病和演進機制研究,為肝癌的早期診斷、有效治療靶點尋找、新治療策略制定提供理論基礎。腫瘤干細胞是腫瘤中一小群干細胞樣的腫瘤細胞亞群,具有起始腫瘤、多向分化、放化療抵抗、免疫耐受和高度的侵襲轉移能力。腫瘤干細胞的存在被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展、復發(fā)轉移的根源,因此破譯腫瘤干細胞干性維持的分子機制,是實現(xiàn)腫瘤治療突破的一個重要方向。近年來,科學家已利用CD133、EpCAM、CD13、CD90、CD24、Nanog等標志物分子證明了肝癌干細胞的存在,但肝癌干細胞復雜的自我更新調控網(wǎng)絡仍不完全清晰,有待更深入地研究。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育,以及腫瘤發(fā)生和演進中發(fā)揮重要作用。Tcf7l1作為Wnt信號通路下游的重要效應分子,不但參與胚胎干細胞和成體干細胞的自我更新調控,也參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Tcf7l1在我國高發(fā)肝癌中的表達和功能仍缺乏較為系統(tǒng)的研究。本課題組在前期肝癌干細胞的相關研究中發(fā)現(xiàn),Tcf7l1是m...

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學位級別】：博士

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英文縮略詞
1 緒論
    1.1 問題提出及研究意義
    1.2 國內外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 TCF/LEF蛋白的結構
        1.2.2 TCF/LEF的 β-catenin依賴與非依賴的轉錄調控作用
        1.2.3 Tcf7l1是胚胎發(fā)育過程中的重要分子
        1.2.4 Tcf7l1在多種惡性腫瘤中促進腫瘤的生長
        1.2.5 Tcf7l1與腫瘤干細胞相關
        1.2.6 Tcf7l1對下游分子的轉錄調控
        1.2.7 Tcf7l1表達的上游調控信號
    1.3 主要研究內容
    1.4 本文的創(chuàng)新點
2 Tcf7l1在肝癌中的表達及臨床意義的研究
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗儀器和材料
        2.2.2 組織蛋白的提取
        2.2.3 BCA法測定蛋白濃度
        2.2.4 蛋白免疫印跡實驗
        2.2.5 免疫組化與評分標準
    2.3 結果
        2.3.1 Tcf7l1在肝癌組織中低表達
        2.3.2 Tcf7l1在肝癌組織中的表達與肝癌患者的不良預后相關
    2.4 討論
    2.5 小結
3 Tcf7l1在肝癌干細胞自我更新中的作用及機制研究
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗儀器和材料
        3.2.2 細胞培養(yǎng)和凍存
        3.2.3 流式細胞分選
        3.2.4 細胞蛋白的提取
        3.2.5 細胞核/漿蛋白的提取
        3.2.6 蛋白免疫印跡實驗
        3.2.7 免疫熒光
        3.2.8 Tcf7l1干擾/過表達慢病毒載體構建、質粒抽提
        3.2.9 慢病毒包裝和細胞感染
        3.2.10 熒光定量PCR
        3.2.11 細胞增殖實驗
        3.2.12 克隆形成實驗
        3.2.13 細胞球形成實驗
        3.2.14 藥物敏感性實驗
        3.2.15 動物成瘤實驗
        3.2.16 ChIP實驗
        3.2.17 熒光素酶報告實驗
    3.3 結果
        3.3.1 Tcf7l1在肝癌干細胞中低表達
        3.3.2 Tcf7l1過表達病毒效果驗證
        3.3.3 Tcf7l1過表達降低肝癌干細胞的自我更新能力,但不影響細胞的增殖
        3.3.4 Tcf7l1過表達改變干性和分化相關基因的表達
        3.3.5 Tcf7l1過表達增加肝癌干細胞對藥物的敏感性
        3.3.6 Tcf7l1過表達抑制肝癌干細胞的致瘤性
        3.3.7 Tcf7l1 抑制Nanog基因的轉錄
        3.3.8 干擾Tcf7l1慢病毒載體構建,干擾效率驗證
        3.3.9 Nanog參與Tcf7l1 調控的自我更新作用
        3.3.10 構建β-catenin結合缺陷的Tcf7l1載體
        3.3.11 Tcf7l1 調控的自我更新作用不依賴于β-catenin
    3.4 討論
    3.5 小結
4 Tcf7l1在肝癌干細胞低表達的上游調控機制研究
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗儀器和材料
        4.2.2 細胞因子或抑制劑處理肝癌細胞
        4.2.3 納米流體蛋白質組學免疫分析(NIA)
        4.2.4 免疫共沉淀實驗
        4.2.5 β-catenin敲除細胞株
        4.2.6 Tcf7l1蛋白降解實驗
    4.3 結果
        4.3.1 IGF信號抑制Tcf7l1 的表達
        4.3.2 Tcf7l1 參與IGF對肝癌干細胞的自我更新調控
        4.3.3 IGF調控Tcf7l1 的蛋白降解
        4.3.4 MEK/ERK信號通路參與Tcf7l1 的降解
        4.3.5 利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除β-catenin
        4.3.6 IGF調控Tcf7l1 的降解不依賴于β-catenin
    4.4 討論
    4.5 小結
5 主要結論和后續(xù)建議
    5.1 主要結論
    5.2 后續(xù)工作建議
參考文獻
附錄
    A 作者在攻讀學位期間發(fā)表的論文目錄
    B 作者在攻讀學位期間參加的科研項目
    C 學位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號：3744301