肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一,我國肝癌發(fā)病率居全球之首,每年新發(fā)病例和死亡患者約占全球總數(shù)的一半。目前肝癌患者的5年生存率僅為15%,因此迫切需要加強(qiáng)肝癌的發(fā)病和演進(jìn)機(jī)制研究,為肝癌的早期診斷、有效治療靶點尋找、新治療策略制定提供理論基礎(chǔ)。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中一小群干細(xì)胞樣的腫瘤細(xì)胞亞群,具有起始腫瘤、多向分化、放化療抵抗、免疫耐受和高度的侵襲轉(zhuǎn)移能力。腫瘤干細(xì)胞的存在被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源,因此破譯腫瘤干細(xì)胞干性維持的分子機(jī)制,是實現(xiàn)腫瘤治療突破的一個重要方向。近年來,科學(xué)家已利用CD133、EpCAM、CD13、CD90、CD24、Nanog等標(biāo)志物分子證明了肝癌干細(xì)胞的存在,但肝癌干細(xì)胞復(fù)雜的自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不完全清晰,有待更深入地研究。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育,以及腫瘤發(fā)生和演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。Tcf7l1作為Wnt信號通路下游的重要效應(yīng)分子,不但參與胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的自我更新調(diào)控,也參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Tcf7l1在我國高發(fā)肝癌中的表達(dá)和功能仍缺乏較為系統(tǒng)的研究。本課題組在前期肝癌干細(xì)胞的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),Tcf7l1是m...

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
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英文縮略詞
1 緒論
    1.1 問題提出及研究意義
    1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 TCF/LEF蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 TCF/LEF的 β-catenin依賴與非依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
        1.2.3 Tcf7l1是胚胎發(fā)育過程中的重要分子
        1.2.4 Tcf7l1在多種惡性腫瘤中促進(jìn)腫瘤的生長
        1.2.5 Tcf7l1與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)
        1.2.6 Tcf7l1對下游分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.2.7 Tcf7l1表達(dá)的上游調(diào)控信號
    1.3 主要研究內(nèi)容
    1.4 本文的創(chuàng)新點
2 Tcf7l1在肝癌中的表達(dá)及臨床意義的研究
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗儀器和材料
        2.2.2 組織蛋白的提取
        2.2.3 BCA法測定蛋白濃度
        2.2.4 蛋白免疫印跡實驗
        2.2.5 免疫組化與評分標(biāo)準(zhǔn)
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 Tcf7l1在肝癌組織中低表達(dá)
        2.3.2 Tcf7l1在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 Tcf7l1在肝癌干細(xì)胞自我更新中的作用及機(jī)制研究
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗儀器和材料
        3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和凍存
        3.2.3 流式細(xì)胞分選
        3.2.4 細(xì)胞蛋白的提取
        3.2.5 細(xì)胞核/漿蛋白的提取
        3.2.6 蛋白免疫印跡實驗
        3.2.7 免疫熒光
        3.2.8 Tcf7l1干擾/過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建、質(zhì)粒抽提
        3.2.9 慢病毒包裝和細(xì)胞感染
        3.2.10 熒光定量PCR
        3.2.11 細(xì)胞增殖實驗
        3.2.12 克隆形成實驗
        3.2.13 細(xì)胞球形成實驗
        3.2.14 藥物敏感性實驗
        3.2.15 動物成瘤實驗
        3.2.16 ChIP實驗
        3.2.17 熒光素酶報告實驗
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 Tcf7l1在肝癌干細(xì)胞中低表達(dá)
        3.3.2 Tcf7l1過表達(dá)病毒效果驗證
        3.3.3 Tcf7l1過表達(dá)降低肝癌干細(xì)胞的自我更新能力,但不影響細(xì)胞的增殖
        3.3.4 Tcf7l1過表達(dá)改變干性和分化相關(guān)基因的表達(dá)
        3.3.5 Tcf7l1過表達(dá)增加肝癌干細(xì)胞對藥物的敏感性
        3.3.6 Tcf7l1過表達(dá)抑制肝癌干細(xì)胞的致瘤性
        3.3.7 Tcf7l1 抑制Nanog基因的轉(zhuǎn)錄
        3.3.8 干擾Tcf7l1慢病毒載體構(gòu)建,干擾效率驗證
        3.3.9 Nanog參與Tcf7l1 調(diào)控的自我更新作用
        3.3.10 構(gòu)建β-catenin結(jié)合缺陷的Tcf7l1載體
        3.3.11 Tcf7l1 調(diào)控的自我更新作用不依賴于β-catenin
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 Tcf7l1在肝癌干細(xì)胞低表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制研究
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗儀器和材料
        4.2.2 細(xì)胞因子或抑制劑處理肝癌細(xì)胞
        4.2.3 納米流體蛋白質(zhì)組學(xué)免疫分析(NIA)
        4.2.4 免疫共沉淀實驗
        4.2.5 β-catenin敲除細(xì)胞株
        4.2.6 Tcf7l1蛋白降解實驗
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 IGF信號抑制Tcf7l1 的表達(dá)
        4.3.2 Tcf7l1 參與IGF對肝癌干細(xì)胞的自我更新調(diào)控
        4.3.3 IGF調(diào)控Tcf7l1 的蛋白降解
        4.3.4 MEK/ERK信號通路參與Tcf7l1 的降解
        4.3.5 利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除β-catenin
        4.3.6 IGF調(diào)控Tcf7l1 的降解不依賴于β-catenin
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 主要結(jié)論和后續(xù)建議
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 后續(xù)工作建議
參考文獻(xiàn)
附錄
    A 作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄
    B 作者在攻讀學(xué)位期間參加的科研項目
    C 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號：3744301