發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 18:18

  本文關(guān)鍵詞：骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2表型分化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤,目前臨床治療以手術(shù)治療為主,輔以放化療,但治療效果仍不理想。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤復(fù)發(fā)難治的根源在于腫瘤中存在著腫瘤干細(xì)胞,目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CD133和CD44為骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志。有研究表明肺腺癌類腫瘤干細(xì)胞表面β1,6分支N-糖鏈表達(dá)異常增加,而乳腺癌表面的β1,6分支N-糖鏈缺失可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型表型轉(zhuǎn)換,使其發(fā)揮抗腫瘤作用。然而,p1,6分支N-糖在骨肉瘤中的作用卻鮮有報(bào)道�；诖�,本研究擬檢測骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞表面N糖苷表達(dá)情況,并研究其對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響,以期進(jìn)一步闡明骨肉瘤腫瘤免疫逃逸機(jī)制,為骨肉瘤的免疫治療奠定基礎(chǔ)。方法：1.通過無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠骨肉瘤細(xì)胞株LM8,初步獲得骨肉瘤懸浮細(xì)胞球,通過磁珠細(xì)胞分選的辦法,通過二次陽性分選得到CD133及CD44雙陽性的LM8細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測分選后細(xì)胞表面CD133分子及CD44分子的表達(dá)情況。2.使用不同劑量的N糖基化抑制劑苦馬豆素處理分選得到的骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞,通過凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞表面β1,6分支N-糖鏈的表達(dá)水平。3.獲取小鼠骨髓細(xì)胞,加入GM-CSF誘導(dǎo)其中單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化,8日后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面巨噬細(xì)胞表面特異性分子F4/80的表達(dá)水平。4.將不同濃度苦馬豆素處理之后的骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞與小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng),熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測巨噬細(xì)胞中iNOS和Arg-1的RNA表達(dá)水平,精氨酸酶活性檢測試劑盒檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中精氨酸酶活性,ELISA法檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a和IL-10含量。結(jié)果：1.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,通過無血清培養(yǎng)初步分離后再進(jìn)行磁珠分選得到的的細(xì)胞中CD133和CD44雙陽性細(xì)胞比例為96.5±1.2%。該結(jié)果表明我們成功分離得到骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞。2.凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示,骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞與L-PHA具有更高的結(jié)合率,達(dá)90.3±2.1%,高于LM8細(xì)胞的結(jié)合率54.3±3.1%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。用lmg/mL的苦馬豆素處理骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞后,細(xì)胞表面β1,6分支N-糖鏈的表達(dá)陽性率為90%,用5mg/mL的苦馬豆素處理骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞后,細(xì)胞表面β1,6分支N-糖鏈的表達(dá)陽性率為21%,以上結(jié)果表明隨著苦馬豆素劑量的增加,骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞表面β1,6分支N-糖鏈的表達(dá)陽性率降低。3.流式細(xì)胞術(shù)檢查結(jié)果顯示,骨髓來源巨噬細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)8天后,F4/80陽性細(xì)胞率為95.4%,表明骨髓來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功。4.骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞與骨髓巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后,與單獨(dú)巨噬細(xì)胞相比,共培養(yǎng)后的巨噬細(xì)胞內(nèi)Arg-1的mRNA表達(dá)量上升(40±2.6% v.s.4±2.6%,P0.05), iNOS mRNA表達(dá)量無顯著差異(12±1.3% v.s.8±4.6%,P0.05),共培養(yǎng)上清中IL-10含量上升(150±6.8pg/mL v.s.50±3.8pg/mL, P0.05), TNF-a含量無顯著差異(50±3.3pg/mL v.s.55±4.8pg/mL, P0.05),該結(jié)果表明與骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞中M2型標(biāo)記分子Arg-1和IL-10表達(dá)上升,M1型標(biāo)記分子iNOS與TNF-a表達(dá)無顯著變化,表明骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化。當(dāng)我們用苦馬豆素(1mg/mL)處理后的骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞與骨髓巨噬細(xì)胞共孵育后,與未處理的骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞相比,巨噬細(xì)胞中M2型標(biāo)記分子Arg-1(12±3.1%v.s.40±2.6%, P0.05)和IL-10(90±4.4 pg/mL v.s.150±6.8 pg/mL,P0.05)表達(dá)下降,M1型標(biāo)記分子iNOS(50±2.1%v.s.12±1.3%, P0.05)TNF-a與(240±8.1pg/mL v.s.50±3.3pg/mL, P0.05)表達(dá)上升,且該變化隨著苦馬豆素濃度的提高而進(jìn)一步增強(qiáng)。結(jié)論：骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞表面高表達(dá)β1,6分支N-糖鏈,苦馬豆素可以降低其細(xì)胞表面β1,6分支N-糖鏈的表達(dá)。骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞可以誘導(dǎo)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞向M2型分化,當(dāng)用苦馬豆素降低骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞表面N糖苷的表達(dá)后其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化的能力減弱。針對(duì)β1,6分支N-糖鏈合成的各類抑制劑,如苦馬豆素,有望成為一種新的治療骨肉瘤的輔助藥物。
【關(guān)鍵詞】：骨肉瘤 腫瘤干細(xì)胞 N糖基化 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R738.1
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 引言14-17
• 第一部分 骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離及鑒定17-24
• 1.實(shí)驗(yàn)材料17-18
• 2 實(shí)驗(yàn)方法18-19
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-20
• 討論20-24
• 第二部分 骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞表面糖鏈表達(dá)檢測24-30
• 1.實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-27
• 討論27-30
• 第三部分 小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定30-34
• 1 小鼠骨髓來源巨睡細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-32
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32
• 討論32-34
• 第四部分 骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞表型影響的研究34-44
• 1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 2 實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-41
• 討論41-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-52
• 綜述一52-74
• 參考文獻(xiàn)63-74
• 綜述二74-101
• 參考文獻(xiàn)89-101
• 攻博期間發(fā)表和待發(fā)表的論文101-102
• 致謝102

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9 朱U，

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