研究目的:在我國,胃癌是一種高發(fā)病率的惡性腫瘤嚴重危害人民健康。蛋白質的糖基化修飾是一種重要的翻譯后修飾,在腫瘤的發(fā)展和轉移過程中均伴有蛋白質異常糖基化修飾的產(chǎn)生。然而異常的糖基化修飾在腫瘤進程中的作用有待進一步闡明。因此,本研究以胃癌細胞及不同分期胃癌患者組織為研究對象,篩選與胃癌相關的異常糖基化修飾,解析糖鏈結構,分析異常糖基化的合成通路以及其對胃癌細胞侵襲和轉移等生物學行為的影響,本研究將為闡明異常糖基化修飾在胃癌發(fā)展中的作用機制提供幫助。方法:1.利用凝集素芯片分析胃癌細胞/胃癌組織的糖蛋白糖鏈譜,篩選與胃癌相關的異常糖蛋白糖鏈,隨后通過凝集素組織化學以及凝集素細胞化學方法在細胞水平上驗證篩選的異常糖蛋白糖鏈;2.構建朝鮮槐凝集素(Maackia amurensis I,MAL-I)-磁性微粒復合物,分別從胃癌細胞/胃癌組織蛋白中分離MAL-I特異性識別的糖蛋白并釋放糖鏈,借助基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)技術解析N-聚糖結構,比較分析胃癌...

【文章頁數(shù)】：179 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語對照表
第一章 緒論
    1.1 胃癌
        1.1.1 胃癌的流行病調查
        1.1.2 胃癌分類與分型
        1.1.3 胃癌的形成原因
            1.1.3.1 幽門螺旋桿菌與胃癌
            1.1.3.2 胃癌患者遺傳因素
    1.2 糖組學
        1.2.1 糖組學概念
        1.2.2 糖與蛋白質糖基化
        1.2.3 腫瘤發(fā)展過程中蛋白質的異常糖基化
        1.2.4 乳糖胺的合成及其生物學功能
    1.3 胃癌相關蛋白質異常糖基化研究現(xiàn)狀
        1.3.1 胃癌發(fā)展過程中異常表達的糖基轉移酶
        1.3.2 胃癌發(fā)展過程中結構發(fā)生改變的糖蛋白糖鏈
    1.4 本研究目的意義與技術路線
第二章 胃癌細胞糖蛋白糖鏈譜研究
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗主要儀器
        2.2.2 實驗試劑及耗材
        2.2.3 實驗溶液配制方法
        2.2.4 數(shù)據(jù)采集及分析軟件
    2.3 實驗方法
        2.3.1 胃癌及正常細胞培養(yǎng)
        2.3.2 細胞總蛋白提取
        2.3.3 環(huán)氧化修飾片基的準備
        2.3.4 凝集素芯片的點制
        2.3.5 細胞蛋白熒光標記與孵育
        2.3.6 芯片數(shù)據(jù)處理
        2.3.7 凝集素細胞化學
    2.4 實驗結果
        2.4.1 胃癌及正常細胞糖蛋白糖鏈譜分析
        2.4.2 凝集素組化驗證
    2.5 本章小結與討論
第三章 不同分期胃癌組織糖蛋白糖鏈譜研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗主要儀器
        3.2.2 實驗試劑及耗材
        3.2.3 實驗溶液配制方法
        3.2.4 數(shù)據(jù)采集及分析軟件
    3.3 實驗方法
        3.3.1 胃癌組織及癌旁組織樣本收集及臨床信息整理
        3.3.2 組織總蛋白提取
        3.3.3 凝集素芯片制備及數(shù)據(jù)處理
        3.3.4 凝集素組化驗證
    3.4 實驗結果
        3.4.1 胃癌與癌旁組織糖蛋白糖鏈譜比較分析
        3.4.2 凝集素組化驗證
    3.5 本章小結與討論
第四章 胃癌細胞及胃癌組織中含LacNAc結構N-聚糖的分離及鑒定
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗主要儀器
        4.2.2 實驗試劑及耗材
        4.2.3 實驗溶液配制方法
        4.2.4 數(shù)據(jù)采集及分析軟件
    4.3 實驗方法
        4.3.1 凝集素磁性微粒復合物制備
        4.3.2 糖蛋白的分離純化
        4.3.3 糖蛋白PNGase F酶解
        4.3.4 N-聚糖脫鹽純化
        4.3.5 N-聚糖質譜解析
        4.3.6 質譜數(shù)據(jù)分析
    4.4 實驗結果
        4.4.1 胃癌細胞MAL-I分離糖蛋白N-聚糖質譜解析結果
        4.4.2 胃癌組織MAL-I分離糖蛋白N-聚糖質譜鑒定結果
    4.5 本章小結與討論
第五章 胃癌相關異常糖蛋白糖鏈的合成通路研究
    5.1 引言
    5.2 實驗材料
        5.2.1 實驗主要儀器
        5.2.2 實驗試劑及耗材
        5.2.3 實驗溶液配制方法
        5.2.4 數(shù)據(jù)采集及分析軟件
    5.3 實驗方法
        5.3.0 胃癌組織RNA提取
        5.3.1 糖相關基因芯片制備
        5.3.2 糖相關基因芯片靶標制備
        5.3.3 糖相關基因芯片雜交及數(shù)據(jù)分析
        5.3.4 Real-Time PCR驗證
        5.3.5 免疫印跡分析
    5.4 實驗結果
        5.4.1 不同分期胃癌組織糖相關基因表達分析
        5.4.2 RT-PCR驗證
        5.4.3 差異表達糖相關基因代謝通路
        5.4.4 差異表達糖相關基因功能分析
        5.4.5 B4GALT3 表達升高與LacNAc的異常積累相關
        5.4.6 結合數(shù)據(jù)庫分析B4GALT3 在胃癌中的表達水平
    5.5 本章小結與討論
第六章 糖基轉移酶B4GALT3 表達對胃癌細胞的影響
    6.1 引言
    6.2 實驗材料
        6.2.1 實驗主要儀器
        6.2.2 實驗試劑及耗材
        6.2.3 實驗溶液配制方法
        6.2.4 數(shù)據(jù)采集及分析軟件
    6.3 實驗方法
        6.3.1 B4GALT3 干擾及過表達慢病毒質粒
        6.3.2 質粒擴增與提取
        6.3.3 慢病毒包裝與濃縮
        6.3.4 測量病毒滴度
        6.3.5 慢病毒轉染
        6.3.6 穩(wěn)轉細胞篩選
        6.3.7 免疫印跡分析干擾及過表達效果
        6.3.8 凝集素芯片分析B4GALT3 表達對MAL-I識別的LacNAc的影響
        6.3.9 B4GALT3 表達對SGC-7901 增殖能力的影響
        6.3.10 B4GALT3 表達對SGC-7901 遷移及侵襲能力的影響
        6.3.11 B4GALT3 表達對SGC-7901 克隆形成能力的影響
    6.4 實驗結果
        6.4.1 轉染效果鑒定
        6.4.2 B4GALT3 表達影響胃癌細胞LacNAc合成
        6.4.3 B4GALT3 表達不影響SGC-7901 增殖能力
        6.4.4 B4GALT3 促進SGC-7901 遷移能力
        6.4.5 B4GALT3 促進SGC-7901 侵襲能力
        6.4.6 B4GALT3 促進SGC-7901 克隆形成能力
    6.5 本章小結與討論
全文總結與展望
參考文獻
附錄
致謝
攻讀博士學位期間取得科研成果
作者簡介



本文編號：3739015