發(fā)布時(shí)間：2017-05-16 16:16

  本文關(guān)鍵詞：TERT促耳蝸前體細(xì)胞增殖及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞為終末感覺細(xì)胞,一旦損傷便難以再生,利用潛在的內(nèi)源性干細(xì)胞替代損傷毛細(xì)胞可能成為最有潛力的治療策略。近年來,研究者們已經(jīng)成功的從出生后早期的哺乳動(dòng)物耳蝸中分離出具有干細(xì)胞功能的耳蝸前體細(xì)胞,并證實(shí)其在體外增殖,并可誘導(dǎo)分化成為毛細(xì)胞樣細(xì)胞。然而耳蝸前體細(xì)胞并非真正意義上的干細(xì)胞,而是介于干細(xì)胞和終末細(xì)胞之間的一類細(xì)胞亞型,其增殖能力有限,隨著細(xì)胞的有絲分裂而逐漸退出細(xì)胞周期。因此,如何維持耳蝸前體細(xì)胞的增殖能力成為研究的焦點(diǎn)。隨著耳聾基礎(chǔ)研究的深入,一些耳蝸發(fā)育相關(guān)的基因已被證實(shí)可以促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞的增殖,在研究中我們檢測了在SD大鼠耳蝸發(fā)育過程和體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞中TERT的表達(dá)變化,結(jié)果提示隨著耳蝸的發(fā)育和耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的降低TERT的表達(dá)逐漸降低。通過腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將TERT轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞,證實(shí)過表達(dá)TERT可以促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞的增殖,并初步證實(shí)Rb/E2F信號(hào)通路可能參與了TERT對(duì)耳蝸前體細(xì)胞增殖的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)一新生SD大鼠耳蝸前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)目的:采用聯(lián)合酶消化的方法建立新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法,以改善原有耳蝸前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法;方法:分離P1-P3 SD大鼠耳蝸基底膜,將基底膜分為四組,分別為:A組:嗜熱菌蛋白酶消化組;B組:Ⅰ型膠原酶消化組;C組:嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶消化組;D組:嗜熱菌蛋白酶消化+機(jī)械分離組。根據(jù)不同的分組進(jìn)行酶消化和細(xì)胞分離,收集細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化,觀察培養(yǎng)獲得的細(xì)胞球數(shù)目,上皮細(xì)胞的純度、細(xì)胞的增殖和定向分化能力。結(jié)果:從4種方法分離得到的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后均可形成細(xì)胞球,表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin和細(xì)胞分裂標(biāo)記物Brd U。經(jīng)過誘導(dǎo)分化后基底膜上皮細(xì)胞可以分化成毛細(xì)胞樣細(xì)胞和支持細(xì)胞,而間質(zhì)細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。采用嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化可以獲得最多數(shù)量的細(xì)胞球,并證實(shí)這些細(xì)胞球?yàn)樯掀碓?各組細(xì)胞的上皮細(xì)胞陽性率無顯著差異。結(jié)論:采用嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化基底膜可以獲得較高純度的上皮細(xì)胞,顯著提高耳蝸前體細(xì)胞的分離效率,該方法改善了原有耳蝸前體細(xì)胞的培養(yǎng)方法,為耳蝸前體細(xì)胞的研究提供了有力工具。實(shí)驗(yàn)二TERT在耳蝸發(fā)育過程中及耳蝸前體細(xì)胞增殖中的表達(dá)目的:TERT對(duì)于維持端粒酶活性具有關(guān)鍵作用,已被證實(shí)可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖,而其在內(nèi)耳細(xì)胞中的作用并不清楚。該實(shí)驗(yàn)的目的是檢測TERT在大鼠耳蝸發(fā)育過程中及耳蝸前體細(xì)胞培養(yǎng)過程中的表達(dá)變化。方法:我們采用分別RT-PCR和Western blot檢測了TERT在P0,P3,P7,P14,P28SD大鼠耳蝸基底膜中的表達(dá)變化。同時(shí)分離培養(yǎng)大鼠耳蝸前體細(xì)胞,采用RT-PCR檢測了在不同培養(yǎng)時(shí)間,不同細(xì)胞球類型及不同傳代的前體細(xì)胞中nestin,PCNA結(jié)果:在出生后早期可以見到基底膜中有較低水平的TERT的表達(dá),隨著耳蝸發(fā)育其表達(dá)水平逐漸降低。體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞傳代,其nestin,PCNA及TERT的表達(dá)逐漸下降,鏤空細(xì)胞球中TERT的表達(dá)水平顯著低于混合性細(xì)胞球組及實(shí)性細(xì)胞球組。結(jié)論:TERT在出生后早期可有較低水平的表達(dá),而隨著耳蝸的發(fā)育其表達(dá)逐漸降低,提示TERT可能與耳蝸的發(fā)育有關(guān)。耳蝸前體細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長及傳代其增殖能力和干細(xì)胞特性降低,同時(shí)伴有TERT的表達(dá)下降,提示TERT可能與耳蝸前體細(xì)胞干細(xì)胞功能的維持有關(guān)。實(shí)驗(yàn)三Ad-TERT-EGFP的構(gòu)建和大鼠耳蝸前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染目的:構(gòu)建攜帶目的基因?yàn)門ERT的腺病毒載體,體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠耳蝸前體細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞狀態(tài),確定適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染滴度。方法:1、構(gòu)建復(fù)制缺陷重組腺病毒:Ad-TERT-EGFP及Ad-EGFP;2、應(yīng)用不同感染復(fù)數(shù)的Ad-EGFP(MOI=250、200、150、100、50、25)轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞,觀察不同滴度轉(zhuǎn)染時(shí)前體細(xì)胞形態(tài)的變化,熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況,確定轉(zhuǎn)染MOI值,計(jì)算陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率;3、應(yīng)用RT-PCR、Western blot檢測Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染后耳蝸前體細(xì)胞中TERT的表達(dá)情況,用TRAP-ELISA檢測轉(zhuǎn)染后耳蝸前體細(xì)胞中端粒酶活性的變化。結(jié)果:收集病毒上清液經(jīng)過鑒定,證實(shí)該重組腺病毒攜帶目的基因片段,病毒滴度為1×1011pfu/ml。在不同的感染復(fù)數(shù)下,EGFP的陽性細(xì)胞的比例隨著MOI值增加而不斷升高,當(dāng)MOI值等于或者低于200時(shí),病毒轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。而當(dāng)MOI250時(shí),病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)貼壁,生長抑制,壞死。確定本實(shí)驗(yàn)MOI值為200,轉(zhuǎn)染后3-4天轉(zhuǎn)染效果達(dá)到最佳,轉(zhuǎn)染效率為32.15±3.12%。以MOI=200將Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞,RT-PCR和Western blot檢測耳蝸前體細(xì)胞中TERT m RNA和蛋白的表達(dá)顯著升高,而端粒酶活性卻沒有顯著變化。結(jié)論:應(yīng)用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可以成功轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后前體細(xì)胞中TERT的表達(dá)顯著升高,為進(jìn)一步研究TERT對(duì)耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的影響奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)四過表達(dá)TERT對(duì)耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的影響目的:通過攜帶TERT的腺病毒將TERT轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞,觀察過表達(dá)TERT后耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的改變。方法:將耳蝸前體細(xì)胞分成三組:Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染組;Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組;對(duì)照組,對(duì)各組細(xì)胞分別進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染,MOI=200,然后分別計(jì)數(shù)耳蝸前體細(xì)胞各類細(xì)胞球所占比例,MTT繪制生長曲線,Ed U染色、RT-PCR及Western blot檢測前體細(xì)胞中PCNA的表達(dá)。結(jié)果:結(jié)果表明進(jìn)行Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染后7天,耳蝸前體細(xì)胞中實(shí)性細(xì)胞球所占比例比Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組顯著升高(P0.05),MTT結(jié)果也提示過表達(dá)TERT后,耳蝸前體細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。Ed U染色提示Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染組耳蝸前體細(xì)胞中Ed U陽性的細(xì)胞百分率顯著高于Ad-EGFP組及對(duì)照組,RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染組中PCNA的表達(dá)顯著高于Ad-EGFP組及對(duì)照組。結(jié)論:過表達(dá)TERT可以促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)五TERT促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞增殖的機(jī)制目的:研究轉(zhuǎn)染Ad-TERT-EGFP耳蝸前體細(xì)胞后促進(jìn)前體細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。方法:應(yīng)用RT-PCR檢測Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染組,Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組中P27KIP1、P53、Rb、E2F、β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2、CDK4、P16INK4a m RNA的表達(dá)水平變化,采用Western blot檢測P27KIP1、P53、Rb、E2F、Cyclin D1、β-catenin蛋白的表達(dá)水平變化。結(jié)果:RT-PCR結(jié)果提示過表達(dá)TERT后,耳蝸前體細(xì)胞中P27KIP1、P53、P16INK4a表達(dá)水平較Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組顯著降低(P0.05),而CDK2、Cyclin D1的表達(dá)較Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組升高。Western blot結(jié)果提示:過表達(dá)TERT后耳蝸前體細(xì)胞中P27KIP1、P53、Rb蛋白的表達(dá)水平較Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組顯著降低,而E2F及Cyclin D1表達(dá)升高。β-catenin蛋白在各組之間的表達(dá)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:過表達(dá)TERT可以促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞增殖,其可能機(jī)制為通過調(diào)控Rb/E2F信號(hào)通路來促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：耳蝸前體細(xì)胞 細(xì)胞增殖 TERT Rb E2F
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R764.43
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-27
• 一、毛細(xì)胞損傷與再生19-20
• 二、耳蝸前體細(xì)胞研究進(jìn)展20-24
• 三、端粒及端粒酶研究進(jìn)展24-27
• 實(shí)驗(yàn)一 新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)27-44
• 1 材料27-29
• 2 方法29-35
• 3 結(jié)果35-42
• 4 討論42-44
• 實(shí)驗(yàn)二TERT在耳蝸發(fā)育過程中及耳蝸前體細(xì)胞中增殖的表達(dá)44-60
• 1 材料44-46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法46-51
• 3 結(jié)果51-57
• 4 討論57-60
• 實(shí)驗(yàn)三Ad-TERT-EGFP的構(gòu)建和大鼠耳蝸前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染60-73
• 1 材料60-61
• 2 方法61-66
• 3 結(jié)果66-70
• 4 討論70-73
• 實(shí)驗(yàn)四 過表達(dá)TERT對(duì)耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的影響73-83
• 1 材料73-74
• 2 方法74-77
• 3 結(jié)果77-80
• 4 討論80-83
• 實(shí)驗(yàn)五TERT促耳蝸前體細(xì)胞增殖的機(jī)制研究83-91
• 1 材料83-84
• 2 方法84-85
• 3 結(jié)果85-88
• 4 討論88-91
• 小結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-108
• 個(gè)人簡歷和研究成果108-110
• 致謝110

  本文關(guān)鍵詞：TERT促耳蝸前體細(xì)胞增殖及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：371320