本文關鍵詞：下調(diào)水通道蛋白-4在腦水腫時可能產(chǎn)生雙刃劍作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的研究抑制水通道蛋白-4對不同損傷程度的體外模型和小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型產(chǎn)生的影響是保護作用還是加重損傷。1.通過轉(zhuǎn)染水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)的siRNA、抑制鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運體(Na+-K+-Cl2-cotransporter, NKCC)和抑制促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)幾種方法來抑制體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細胞AQP4的表達,然后對細胞進行不同程度的氣壓損傷。觀察被下調(diào)了AQP4的大鼠星形膠質(zhì)細胞氣壓損傷后水腫高峰時的情況。2.研究通過抑制促絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)的活性下調(diào)AQP4的表達,對不同程度小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦水腫、神經(jīng)功能缺損評級的影響和組織發(fā)生凋亡的情況。方法1.原代培養(yǎng)SD大鼠星形膠質(zhì)細胞。對培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞進行不同壓力的(1.0MPa、1.5MPa、2.0MPa和2.5MPa)氣壓損傷,觀察各個壓力損傷后細胞存活情況,并在損傷后3h測各組的AQP4的表達。選出適合的壓力再用于進一步的實驗。用兩個不同的壓力制造不同程度的細胞損傷,每個損傷程度下分陰性對照組(Control)、陽性對照組(T)、siRNA處理組、布美他尼處理組(bumetanide, BU)和p38-MAPK抑制劑(SB203580, SB)處理組。構建沉默AQP4 mRNA的siRNA,質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染大鼠星形膠質(zhì)細胞,轉(zhuǎn)染成功48h后進行氣壓損傷。布美他尼和p38-MAPK抑制劑均預處理星形膠質(zhì)細胞30min后再進行氣壓損傷。損傷后在細胞水腫高峰3h利用流式細胞儀前向角散射光(forward side scatter, FSC)的強度與細胞大小成正比來檢測細胞相對體積,判斷細胞的水腫情況,用Western blot對AQP4的表達情況進行檢測,并通過Annexin-V/PI染色法檢測細胞凋亡和壞死程度。2.首先取健康成年昆明小白鼠90只,體重18-22g,隨機分成陽性對照組(T1.5、T2.5)、p38-MAPK抑制劑組(SB1.5、SB2.5)和陰性對照組(C),每組18只。用線栓法制作不同程度的小鼠局部性腦缺血損傷模型(分別栓塞1.5h和2.5h后拔出線栓),SB組造模前30min分別給小鼠腹腔注射SB203580(20mg/kg)。按分組時間栓塞小鼠右側(cè)大腦中動脈后再拔出,建立局灶性腦缺血再灌注模型,每組12只動物模型在術后24h水腫高峰時段處死取腦組織,6只用于干濕重法檢測腦組織含水量；6只用于Western blot檢測AQP4和Caspase-3的表達量。剩余的6只動物模型每日進行神經(jīng)功能缺損評級,其中SB組每日腹腔注射SB203580一次,至第7天處死行病理切片觀察腦組織損傷情況。3.結果1.原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細胞生長良好,經(jīng)轉(zhuǎn)染AQP4的siRNA后明顯下調(diào)了星形膠質(zhì)細胞AQP4的表達。氣壓損傷后3h經(jīng)流式細胞儀前向角散射光檢測1.5MPa、2.0MPa壓力損傷后陽性對照組細胞體積明顯增大,2.0MPa陽性對照組體積明顯大于1.5MPa陽性對照組(P0.05)。各干預組細胞體積均小于其陽性對照組。除1.5MPa損傷下的siRNA組和SB組外其余各組細胞體積均大于陰性對照組,且以2.0MPa陽性組增大最明顯(P0.01)。1.5MPa壓力損傷下的siRNA干擾組、布美他尼組和p38-MAPK抑制劑組星形膠質(zhì)細胞水腫較陽性對照組減輕(P0.05),但發(fā)生凋亡的細胞也較陽性對照組增多(P0.05)。2.0MPa壓力損傷后3h各組細胞均有較多死亡。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)siRNA干擾組、布美他尼組和p38-MAPK抑制劑組的AQP4表達均較其陽性對照組低(P0.05)。2.在1.5h和2.5h的缺血損傷程度下,24h時p38-MAPK抑制劑組(SB1.5、SB2.5)腦含水量和水通道蛋白的表達量都明顯低于陽性對照組(T1.5、T2.5)(P0.05),但Caspase-3的表達量均高于陽性對照組。SB1.5組腦含水量和水通道蛋白的表達量與陰性對照比較無明顯差異(P0.05)。其余組均高于陰性對照組并有統(tǒng)計學意義。在7天的神經(jīng)功能缺損評級中。T1.5與SB1.5在7天總體的神經(jīng)功能損傷評級比較中沒有顯著性差異,但均高于陰性對照組(P0.05)。T1.5組在第4天時小鼠的神經(jīng)功能缺損評級降低,且低于SB1.5組(P0.05)。第7天時SB 1.5組的神經(jīng)功能損傷評級也降低,同T1.5組比較沒有顯著差異(P0.05)。T2.5組7天總的神經(jīng)功能缺損評級明顯高于SB2.5組(P0.05)。結論1.大鼠星形膠質(zhì)細胞在1.5MPa壓力的氣壓損傷后3h,AQP4表達上調(diào),細胞水腫。通過siRNA干擾、抑制NKCC和p38-MAPK信號途徑可下調(diào)AQP4的表達減輕星形膠質(zhì)細胞水腫。但AQP4在星形膠質(zhì)細胞的修復、遷移中也發(fā)揮著重要的作用,抑制AQP4的表達在減輕水腫的同時也影響到了星形膠質(zhì)細胞修復。另外細胞水腫本身也是對損傷的適應性反應,通過水腫稀釋胞內(nèi)因為損傷升高的離子濃度。所以可能在通過下調(diào)AQP4的時候也延緩了細胞的修復而介導了細胞的凋亡。另外由于細胞周圍的空間并不是固定的,所以在陽性對照組細胞水腫的時候并沒有因自身的水腫使周圍壓力繼續(xù)上升而進步損傷細胞。2.0MPa的壓力時,因細胞承受的壓力的損傷較大,直接導致了大量細胞的壞死。在此實驗中下調(diào)AQP4雖然能減輕細胞的水腫,但同時也促進了細胞的凋亡,從存活細胞數(shù)上并沒有表現(xiàn)出保護作用。2.在小鼠局灶性腦缺血損傷,腦水腫形成中,通過抑制p38-MAPK信號途徑,可抑制AQP4的表達,減輕腦水腫。可能在缺血1.5h的情況下并沒有引起嚴重的腦水腫,所以T1.5組在水腫消退后神經(jīng)功能得以恢復。而SB1.5組在下調(diào)AQP4的表達減輕水腫的同時也促使了一部分細胞發(fā)生凋亡,并可能抑制了AQP4介導的星形膠質(zhì)細胞的遷移和修復功能,因此細胞的凋亡以及恢復的減慢,使得在第4、5天時出現(xiàn)損傷較T1.5組重的表現(xiàn)。但在缺血2.5h的情況下,因為較重的損傷使得損傷區(qū)域的腦組織水腫嚴重,顱內(nèi)壓升高,繼而引起了周圍腦組織的水腫形成惡性循環(huán)。所以陽性對照組的神經(jīng)功能缺損評級較高。此時SB2.5組因抑制AQP4的表達減輕了腦水腫,并因部分細胞的凋亡緩解了顱內(nèi)壓的進步升高起到了保護作用。綜合來看抑制AQP4的表達會產(chǎn)生雙向性的作用,如何才能使利大于弊?需進步研究干預的時機。
【關鍵詞】：水通道蛋白-4 腦水腫 siRNA 星形膠質(zhì)細胞氣壓損傷 p38-MAPK NKCC
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中英文縮略詞表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 引言15-19
• 參考文獻17-19
• 第一部分下調(diào)AQP4對星形膠質(zhì)細胞氣壓損傷后的影響19-66
• 一、星形膠質(zhì)細胞氣壓損傷模型的構建20-28
• 1.材料與方法20-26
• 2.結果26-28
• 二、重組大鼠AQP4基因RNAi慢病毒載體質(zhì)粒的構建及鑒定28-44
• 1.材料與方法28-41
• 2.結果41-44
• 三、pXPR1_011>AQP4·siRNA質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞44-51
• 1.材料與方法44-48
• 2.結果48-51
• 四、下調(diào)星形膠質(zhì)細胞AQP4的表達對星形膠質(zhì)細胞在1.5MPa和2.0MPa巧力損傷后的影響51-60
• 1.材料和方法51-55
• 2.結果55-60
• 討論60-62
• 結論62-63
• 參考文獻63-66
• 第二部分 抑制不同程度小鼠局灶性腦缺血損傷后水通道蛋白-4的表達所產(chǎn)生的神經(jīng)功能結果研究66-99
• 一、小鼠局部腦缺血再灌注后腦水腫和AQP4表達的情況67-80
• 1.材料與方法67-77
• 2.結果77-80
• 二、抑制AQP4的表達對不同程度小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的影響80-93
• 1.材料與方法81-87
• 2.結果87-93
• 討論93-96
• 結論96
• 參考文獻96-99
• 綜述一99-107
• 參考文獻103-107
• 個人簡歷107
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況107-108
• 致謝108

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Wen-Zhen Shi;Chun-Zhen Zhao;Bing Zhao;Qiao-Juan Shi;Li-Hui Zhang;Yan-Fang Wang;San-Hua Fang;Yun-Bi Lu;Wei-Ping Zhang;Er-Qing Wei;;Aggravated inflammation and increased expression of cysteinyl leuko-triene receptors in the brain after focal cerebral ischemia in AQP4-deficient mice[J];Neuroscience Bulletin;2012年06期

  本文關鍵詞：下調(diào)水通道蛋白-4在腦水腫時可能產(chǎn)生雙刃劍作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：369486