本文關(guān)鍵詞：下調(diào)水通道蛋白-4在腦水腫時可能產(chǎn)生雙刃劍作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的研究抑制水通道蛋白-4對不同損傷程度的體外模型和小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型產(chǎn)生的影響是保護(hù)作用還是加重?fù)p傷。1.通過轉(zhuǎn)染水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)的siRNA、抑制鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+-K+-Cl2-cotransporter, NKCC)和抑制促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)幾種方法來抑制體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá),然后對細(xì)胞進(jìn)行不同程度的氣壓損傷。觀察被下調(diào)了AQP4的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氣壓損傷后水腫高峰時的情況。2.研究通過抑制促絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)的活性下調(diào)AQP4的表達(dá),對不同程度小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦水腫、神經(jīng)功能缺損評級的影響和組織發(fā)生凋亡的情況。方法1.原代培養(yǎng)SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。對培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行不同壓力的(1.0MPa、1.5MPa、2.0MPa和2.5MPa)氣壓損傷,觀察各個壓力損傷后細(xì)胞存活情況,并在損傷后3h測各組的AQP4的表達(dá)。選出適合的壓力再用于進(jìn)一步的實驗。用兩個不同的壓力制造不同程度的細(xì)胞損傷,每個損傷程度下分陰性對照組(Control)、陽性對照組(T)、siRNA處理組、布美他尼處理組(bumetanide, BU)和p38-MAPK抑制劑(SB203580, SB)處理組。構(gòu)建沉默AQP4 mRNA的siRNA,質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功48h后進(jìn)行氣壓損傷。布美他尼和p38-MAPK抑制劑均預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞30min后再進(jìn)行氣壓損傷。損傷后在細(xì)胞水腫高峰3h利用流式細(xì)胞儀前向角散射光(forward side scatter, FSC)的強(qiáng)度與細(xì)胞大小成正比來檢測細(xì)胞相對體積,判斷細(xì)胞的水腫情況,用Western blot對AQP4的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,并通過Annexin-V/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡和壞死程度。2.首先取健康成年昆明小白鼠90只,體重18-22g,隨機(jī)分成陽性對照組(T1.5、T2.5)、p38-MAPK抑制劑組(SB1.5、SB2.5)和陰性對照組(C),每組18只。用線栓法制作不同程度的小鼠局部性腦缺血損傷模型(分別栓塞1.5h和2.5h后拔出線栓),SB組造模前30min分別給小鼠腹腔注射SB203580(20mg/kg)。按分組時間栓塞小鼠右側(cè)大腦中動脈后再拔出,建立局灶性腦缺血再灌注模型,每組12只動物模型在術(shù)后24h水腫高峰時段處死取腦組織,6只用于干濕重法檢測腦組織含水量；6只用于Western blot檢測AQP4和Caspase-3的表達(dá)量。剩余的6只動物模型每日進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評級,其中SB組每日腹腔注射SB203580一次,至第7天處死行病理切片觀察腦組織損傷情況。3.結(jié)果1.原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞生長良好,經(jīng)轉(zhuǎn)染AQP4的siRNA后明顯下調(diào)了星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)。氣壓損傷后3h經(jīng)流式細(xì)胞儀前向角散射光檢測1.5MPa、2.0MPa壓力損傷后陽性對照組細(xì)胞體積明顯增大,2.0MPa陽性對照組體積明顯大于1.5MPa陽性對照組(P0.05)。各干預(yù)組細(xì)胞體積均小于其陽性對照組。除1.5MPa損傷下的siRNA組和SB組外其余各組細(xì)胞體積均大于陰性對照組,且以2.0MPa陽性組增大最明顯(P0.01)。1.5MPa壓力損傷下的siRNA干擾組、布美他尼組和p38-MAPK抑制劑組星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫較陽性對照組減輕(P0.05),但發(fā)生凋亡的細(xì)胞也較陽性對照組增多(P0.05)。2.0MPa壓力損傷后3h各組細(xì)胞均有較多死亡。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)siRNA干擾組、布美他尼組和p38-MAPK抑制劑組的AQP4表達(dá)均較其陽性對照組低(P0.05)。2.在1.5h和2.5h的缺血損傷程度下,24h時p38-MAPK抑制劑組(SB1.5、SB2.5)腦含水量和水通道蛋白的表達(dá)量都明顯低于陽性對照組(T1.5、T2.5)(P0.05),但Caspase-3的表達(dá)量均高于陽性對照組。SB1.5組腦含水量和水通道蛋白的表達(dá)量與陰性對照比較無明顯差異(P0.05)。其余組均高于陰性對照組并有統(tǒng)計學(xué)意義。在7天的神經(jīng)功能缺損評級中。T1.5與SB1.5在7天總體的神經(jīng)功能損傷評級比較中沒有顯著性差異,但均高于陰性對照組(P0.05)。T1.5組在第4天時小鼠的神經(jīng)功能缺損評級降低,且低于SB1.5組(P0.05)。第7天時SB 1.5組的神經(jīng)功能損傷評級也降低,同T1.5組比較沒有顯著差異(P0.05)。T2.5組7天總的神經(jīng)功能缺損評級明顯高于SB2.5組(P0.05)。結(jié)論1.大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞在1.5MPa壓力的氣壓損傷后3h,AQP4表達(dá)上調(diào),細(xì)胞水腫。通過siRNA干擾、抑制NKCC和p38-MAPK信號途徑可下調(diào)AQP4的表達(dá)減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。但AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)、遷移中也發(fā)揮著重要的作用,抑制AQP4的表達(dá)在減輕水腫的同時也影響到了星形膠質(zhì)細(xì)胞修復(fù)。另外細(xì)胞水腫本身也是對損傷的適應(yīng)性反應(yīng),通過水腫稀釋胞內(nèi)因為損傷升高的離子濃度。所以可能在通過下調(diào)AQP4的時候也延緩了細(xì)胞的修復(fù)而介導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。另外由于細(xì)胞周圍的空間并不是固定的,所以在陽性對照組細(xì)胞水腫的時候并沒有因自身的水腫使周圍壓力繼續(xù)上升而進(jìn)步損傷細(xì)胞。2.0MPa的壓力時,因細(xì)胞承受的壓力的損傷較大,直接導(dǎo)致了大量細(xì)胞的壞死。在此實驗中下調(diào)AQP4雖然能減輕細(xì)胞的水腫,但同時也促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡,從存活細(xì)胞數(shù)上并沒有表現(xiàn)出保護(hù)作用。2.在小鼠局灶性腦缺血損傷,腦水腫形成中,通過抑制p38-MAPK信號途徑,可抑制AQP4的表達(dá),減輕腦水腫�？赡茉谌毖�1.5h的情況下并沒有引起嚴(yán)重的腦水腫,所以T1.5組在水腫消退后神經(jīng)功能得以恢復(fù)。而SB1.5組在下調(diào)AQP4的表達(dá)減輕水腫的同時也促使了一部分細(xì)胞發(fā)生凋亡,并可能抑制了AQP4介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移和修復(fù)功能,因此細(xì)胞的凋亡以及恢復(fù)的減慢,使得在第4、5天時出現(xiàn)損傷較T1.5組重的表現(xiàn)。但在缺血2.5h的情況下,因為較重的損傷使得損傷區(qū)域的腦組織水腫嚴(yán)重,顱內(nèi)壓升高,繼而引起了周圍腦組織的水腫形成惡性循環(huán)。所以陽性對照組的神經(jīng)功能缺損評級較高。此時SB2.5組因抑制AQP4的表達(dá)減輕了腦水腫,并因部分細(xì)胞的凋亡緩解了顱內(nèi)壓的進(jìn)步升高起到了保護(hù)作用。綜合來看抑制AQP4的表達(dá)會產(chǎn)生雙向性的作用,如何才能使利大于弊?需進(jìn)步研究干預(yù)的時機(jī)。
【關(guān)鍵詞】：水通道蛋白-4 腦水腫 siRNA 星形膠質(zhì)細(xì)胞氣壓損傷 p38-MAPK NKCC
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中英文縮略詞表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 引言15-19
• 參考文獻(xiàn)17-19
• 第一部分下調(diào)AQP4對星形膠質(zhì)細(xì)胞氣壓損傷后的影響19-66
• 一、星形膠質(zhì)細(xì)胞氣壓損傷模型的構(gòu)建20-28
• 1.材料與方法20-26
• 2.結(jié)果26-28
• 二、重組大鼠AQP4基因RNAi慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定28-44
• 1.材料與方法28-41
• 2.結(jié)果41-44
• 三、pXPR1_011>AQP4·siRNA質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞44-51
• 1.材料與方法44-48
• 2.結(jié)果48-51
• 四、下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞在1.5MPa和2.0MPa巧力損傷后的影響51-60
• 1.材料和方法51-55
• 2.結(jié)果55-60
• 討論60-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 第二部分 抑制不同程度小鼠局灶性腦缺血損傷后水通道蛋白-4的表達(dá)所產(chǎn)生的神經(jīng)功能結(jié)果研究66-99
• 一、小鼠局部腦缺血再灌注后腦水腫和AQP4表達(dá)的情況67-80
• 1.材料與方法67-77
• 2.結(jié)果77-80
• 二、抑制AQP4的表達(dá)對不同程度小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的影響80-93
• 1.材料與方法81-87
• 2.結(jié)果87-93
• 討論93-96
• 結(jié)論96
• 參考文獻(xiàn)96-99
• 綜述一99-107
• 參考文獻(xiàn)103-107
• 個人簡歷107
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況107-108
• 致謝108

【參考文獻(xiàn)】

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1 Wen-Zhen Shi;Chun-Zhen Zhao;Bing Zhao;Qiao-Juan Shi;Li-Hui Zhang;Yan-Fang Wang;San-Hua Fang;Yun-Bi Lu;Wei-Ping Zhang;Er-Qing Wei;;Aggravated inflammation and increased expression of cysteinyl leuko-triene receptors in the brain after focal cerebral ischemia in AQP4-deficient mice[J];Neuroscience Bulletin;2012年06期

  本文關(guān)鍵詞：下調(diào)水通道蛋白-4在腦水腫時可能產(chǎn)生雙刃劍作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：369486