生物藥從出現(xiàn)至今憑借卓越的療效、生物科技的快速發(fā)展以及研發(fā)投入的不斷增加,已成為制藥行業(yè)近年來發(fā)展最快的子行業(yè)。2019年生物藥的全球市場規(guī)模已超過3000億美元,其中抗體類相關(guān)藥物（完整抗體、Fc融合蛋白、雙特異性抗體等）占據(jù)了大部分。中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）因具有較理想的翻譯后修飾功能,一直是生物藥制備的主要表達(dá)載體。在已經(jīng)上市的抗體類藥物中約7成都是在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的。雖然利用CHO細(xì)胞進(jìn)行抗體類藥物制備的產(chǎn)量在過去的幾十年有了很大提升,但面對市場規(guī)模的不斷加大,其產(chǎn)能仍難滿足需求,所以提高CHO細(xì)胞株的產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Fc融合蛋白與完整抗體相比,沒有輕重鏈之間的相互作用,在表達(dá)機(jī)制上必然有所不同,為了了解CHO細(xì)胞中與Fc重組蛋白產(chǎn)量相關(guān)的部分機(jī)制,本研究首先對CHO-K1貼壁細(xì)胞進(jìn)行了無血清全懸浮馴化,然后利用編碼有G1p1-Fc融合蛋白的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,通過單克隆篩選獲得了 5株具有不同重組蛋白表達(dá)水平的CHO細(xì)胞,各細(xì)胞株的產(chǎn)能經(jīng)過ELISA及免疫熒光觀察的雙重確認(rèn)后對各細(xì)胞株進(jìn)行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析。為使后續(xù)的試驗結(jié)果能夠盡量客觀地反應(yīng)胞內(nèi)的相關(guān)... 

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
第一章 前言
    1.1 中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)
        1.1.1 CHO細(xì)胞與抗體類藥物的生產(chǎn)
        1.1.2 CHO細(xì)胞的基因工程改造
    1.2 GLP1-Fc融合蛋白
    1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)
    1.4 內(nèi)參基因
    1.5 RNA干擾(RNAi)技術(shù)
    1.6 medag基因
    1.7 本試驗的研究目的
第二章 表達(dá)GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1細(xì)胞株構(gòu)建
    2.1 試驗材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 試劑及耗材
        2.1.4 主要儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.2.2 貼壁細(xì)胞傳代
        2.2.3 懸浮細(xì)胞傳代
        2.2.4 無血清懸浮馴化
        2.2.5 P3.1-GLP1-Fc-GS載體構(gòu)建
        2.2.6 CHO-K1宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及單克隆篩選
        2.2.7 ELISA檢測Fc融合蛋白濃度
        2.2.8 細(xì)胞凍存
        2.2.9 細(xì)胞比生產(chǎn)速率的計算
        2.2.10 RNA提取
        2.2.11 反轉(zhuǎn)錄
        2.2.12 RT-qPCR
        2.2.13 免疫熒光觀察
    2.3 試驗結(jié)果
        2.3.1 CHO-K1細(xì)胞的無血清全懸浮馴化
        2.3.2 P3.1-GLP-1 Fc-GS質(zhì)粒提取驗證結(jié)果
        2.3.3 具有不同GLP1-Fc表達(dá)量的CHO-K1細(xì)胞株篩選
            2.3.3.1 96孔板細(xì)胞株產(chǎn)量
            2.3.3.2 24孔板細(xì)胞株產(chǎn)量
            2.3.3.3 不同重組蛋白生產(chǎn)率的CHO細(xì)胞株的確定及75天傳代培養(yǎng)穩(wěn)定性檢測
            2.3.3.4 GLP1-Fc融合蛋白產(chǎn)率及基因拷貝數(shù)的測定
            2.3.3.5 免疫熒光法觀察重組蛋白分布
    2.4 小結(jié)
第三章 表達(dá)GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1細(xì)胞株的轉(zhuǎn)錄組測序分析
    3.1 試驗材料
        3.1.1 細(xì)胞株
        3.1.2 培養(yǎng)基
        3.1.3 試劑及耗材
        3.1.4 主要儀器
    3.2 試驗方法
        3.2.1 RNA提取
        3.2.2 RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序分析
    3.3 試驗結(jié)果
        3.3.1 RNA提取
        3.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析
            3.3.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量及基因表達(dá)量結(jié)果
            3.3.2.2 差異表達(dá)基因分析
    3.4 小結(jié)
第四章 表達(dá)GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1細(xì)胞中內(nèi)參基因的確認(rèn)
    4.1 試驗材料
        4.1.1 細(xì)胞株
        4.1.2 培養(yǎng)基
        4.1.3 試劑及耗材
        4.1.4 主要儀器
    4.2 試驗方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 候選內(nèi)參基因的確定
        4.2.3 引物設(shè)計
        4.2.4 RNA提取及cDNA合成
        4.2.5 RT-qPCR
        4.2.6 內(nèi)參基因檢測結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析
    4.3 試驗結(jié)果
        4.3.1 75天穩(wěn)定性生長及加料培養(yǎng)生長結(jié)果
        4.3.2 候選內(nèi)參基因的確定
        4.3.3 候選內(nèi)參基因的引物設(shè)計
        4.3.4 候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平檢測
        4.3.5 geNorm分析
        4.3.6 NormFinder分析
        4.3.7 ACt法分析
        4.3.8 BestKeeper分析
        4.3.9 RefFinder分析
        4.3.10 內(nèi)參基因的驗證
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 RNA干擾法篩選影響Fc融合蛋白產(chǎn)量的潛在基因
    5.1 試驗材料
        5.1.1 細(xì)胞株
        5.1.2 培養(yǎng)基
        5.1.3 試劑及耗材
        5.1.4 主要儀器
    5.2 試驗方法
        5.2.1 待測基因的RT-qPCR驗證及引物設(shè)計
        5.2.2 RNA提取及cDNA合成
        5.2.3 RT-qPCR
        5.2.4 siRNA的設(shè)計
        5.2.5 siRNA干擾試驗
        5.2.6 ELISA產(chǎn)量檢測
        5.2.7 shRNA質(zhì)粒的合成
        5.2.8 shRNA質(zhì)粒的提取、驗證及線性化
        5.2.9 轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定株篩選
        5.2.10 穩(wěn)定株生長參數(shù)考察
    5.3 試驗結(jié)果
        5.3.1 目標(biāo)基因的RT-qPCR驗證
        5.3.2 目標(biāo)基因的siRNA分子序列
        5.3.3 siRNA干擾試驗初篩結(jié)果
        5.3.4 siRNA干擾試驗結(jié)果的復(fù)證
        5.3.5 shRNA質(zhì)粒提取及酶切線性化結(jié)果
        5.3.6 穩(wěn)定株篩選結(jié)果
        5.3.7 穩(wěn)定株生長及生產(chǎn)參數(shù)的考察
    5.4 小結(jié)
總結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]RNA干擾在生物基因治療中的應(yīng)用及意義[J]. 肖倩,孫曉寧.  中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志. 2015(01)
[2]SM22啟動SCAP真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在CHO細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 王媛媛,胡接力,崔靜,黃愛龍,阮雄中,陳壓西.  生物工程學(xué)報. 2010(01)



本文編號：3680860