本文關(guān)鍵詞：IL-1β對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性中施旺細(xì)胞的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景組織創(chuàng)傷修復(fù)是整形外科研究領(lǐng)域的傳統(tǒng)熱點(diǎn)和難點(diǎn),而該領(lǐng)域內(nèi)的再生醫(yī)學(xué)研究已成為近年來(lái)的整形外科的重點(diǎn)研究方向。再生醫(yī)學(xué)的最終目的是使得受損的組織或器官修復(fù)再生。而機(jī)體損傷的修復(fù)與再生主要通過(guò)參與損傷修復(fù)的細(xì)胞去分化(Dedifferentiation)、轉(zhuǎn)分化(Transdifferentiation)和重編程(Reprogramming)。人作為哺乳動(dòng)物,僅具備有限的組織和器官再生能力,如肝臟和血液。而一些非哺乳動(dòng)物則具有非凡的再生能力,如斑馬魚(yú)和蠑螈等。這些非哺乳動(dòng)物的可再生組織在創(chuàng)傷發(fā)生后,受損區(qū)域的成體細(xì)胞發(fā)生去分化和增殖,參與組織的修復(fù)再生。通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)等經(jīng)典的再生修復(fù)模型的研究,有學(xué)者提出組織再生的核心問(wèn)題是新生組織的細(xì)胞來(lái)源,而參與再生的細(xì)胞主要來(lái)源于干細(xì)胞和去分化的成體細(xì)胞。以往再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究多集中于干細(xì)胞治療研究上。既往有學(xué)者研究表明,雖然干細(xì)胞移植治療能夠促進(jìn)創(chuàng)傷愈合,但干細(xì)胞的移植并未本質(zhì)上改變創(chuàng)傷愈合的方式。干細(xì)胞移植治療只是促進(jìn)了愈合的過(guò)程,其移植的干細(xì)胞主要是通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的,其自身分化為新生組織的比例很低。而斑馬魚(yú)心肌再生機(jī)制中所涉及的“成體細(xì)胞的去分化及增殖”機(jī)制逐漸引起了研究者的濃厚興趣。在斑馬魚(yú)心肌局部受損后,成熟心肌細(xì)胞開(kāi)始去分化,并重新進(jìn)入細(xì)胞周期開(kāi)始增殖,這一過(guò)程是斑馬魚(yú)心肌局部受損修復(fù)再生的基礎(chǔ)。這種“成體細(xì)胞的去分化及增殖”的組織再生機(jī)制與人體周?chē)窠?jīng)受損后修復(fù)再生過(guò)程有相似之處,即損傷修復(fù)過(guò)程與受損組織的主要成分細(xì)胞去分化及增殖密切相關(guān),即斑馬魚(yú)的心肌細(xì)胞和人體的施旺細(xì)胞(Schwann Cell)。施旺細(xì)胞是構(gòu)成周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。施旺細(xì)胞參與了多種十分重要的周?chē)窠?jīng)生物學(xué)功能：參與神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo),參與神經(jīng)的生長(zhǎng)和再生,并具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元,生產(chǎn)神經(jīng)細(xì)胞外介質(zhì),調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)活性以及介導(dǎo)抗原的作用。當(dāng)周?chē)窠?jīng)損傷后,發(fā)生一系列細(xì)胞和分子生物學(xué)變性-華勒氏變性(Wallerian degeneration)。華勒氏變性過(guò)程中,施旺細(xì)胞的去分化為神經(jīng)再生提供再生支架和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,以及引導(dǎo)軸突延伸并維持神經(jīng)元的活力,促進(jìn)再生神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù),施旺細(xì)胞的去分化是周?chē)窠?jīng)再生的基礎(chǔ)。因此,我們認(rèn)為,對(duì)周神經(jīng)系統(tǒng)損傷后施旺細(xì)胞去分化的干預(yù)因素及其作用機(jī)制展開(kāi)深入研究對(duì)于促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)的研究發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。需要注意的是,本研究所講華勒氏變性均是指外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒氏變性,這并不表示中樞神經(jīng)系統(tǒng)不發(fā)生華勒氏變性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),雖然有與外周神經(jīng)系統(tǒng)施旺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte)和小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia),在神經(jīng)組織受損后也會(huì)發(fā)生華勒氏變性,只是中樞神經(jīng)系統(tǒng)華勒氏變性的結(jié)果卻完全不同。中樞神經(jīng)系統(tǒng)華勒氏變性并不能像外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒氏變性那樣清除髓鞘崩解的碎片,并不能形成組織損傷修復(fù)再生。在外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性過(guò)程中,單核/巨噬細(xì)胞激活并聚集于損傷區(qū)域,巨噬細(xì)胞分泌包括IL-1β在內(nèi)的等多種炎癥因子,并與施旺細(xì)胞共同參與清除髓鞘崩解的碎片,參與華勒變性,并影響神經(jīng)再生的進(jìn)程。并且,在單核/巨噬細(xì)胞激活并聚集于損傷區(qū)域之前,受損后的外周神經(jīng)組織即開(kāi)始高表達(dá)包括IL-1β在內(nèi)的等多種炎癥因子。研究表明,IL-1β可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞遷移至損傷部位參與髓鞘碎片的清除以利于神經(jīng)再生。除了作用于單核巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)以外,IL-1p還可通過(guò)直接或間接的途徑促進(jìn)神經(jīng)元的存活。并且,IL-1β可增加神經(jīng)受損區(qū)域施旺細(xì)胞NGF mRNA的表達(dá)量及NGF的蛋白分泌量,而NGF具有促進(jìn)神經(jīng)元存活及神經(jīng)突生長(zhǎng)的作用。既往有研究者通過(guò)IL-1p早期干預(yù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型,提示IL-1p通過(guò)促進(jìn)損傷區(qū)域神經(jīng)元存活和神經(jīng)突生長(zhǎng),以促進(jìn)外周神經(jīng)再生�？梢�(jiàn),IL-1p在外周神經(jīng)損傷早期具有重要的作用。然而,上述研究并未涉及IL-1β對(duì)外周神經(jīng)再生過(guò)程中施旺細(xì)胞去分化的影響。既往卻有研究表明IL-1β通過(guò)c-Jun/AP-1通路促使軟骨細(xì)胞去分化。既往研究發(fā)現(xiàn),c-Jun于體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中均可抑制施旺細(xì)胞髓鞘化,促使分化成熟施旺細(xì)胞發(fā)生去分化。在小鼠動(dòng)物模型中,選擇性敲除施旺細(xì)胞中的c-Jun基因,雖然不會(huì)影響外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生長(zhǎng),但會(huì)使外周神經(jīng)喪失再生能力；致使華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞的分子表型及Bungner's帶的結(jié)構(gòu)異常,以及影響神經(jīng)元的存活,軸索的再生等。小鼠脊髓損傷模型中,施旺細(xì)胞中c-Jun缺失會(huì)導(dǎo)致外周神經(jīng)損傷后,神經(jīng)元壞死量增多,以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)降低。同時(shí)又有研究表明,c-Jun跟細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切。采用顯微注射特異性c-Jun抗體干擾其功能,或采用去除轉(zhuǎn)錄激活區(qū)保留DNA結(jié)合區(qū)的負(fù)顯性c-Jun突變體阻斷c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性,這些降低c-Jun活性的干預(yù)均可有效地阻滯神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。并有研究認(rèn)為c-Jun的轉(zhuǎn)錄活化是誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡所必需。這些研究結(jié)果及觀點(diǎn)雖有所不同,但仍然可以看到,c-Jun相關(guān)通路在周?chē)窠?jīng)再生及施旺細(xì)胞去分化、增殖、凋亡等方面具有十分關(guān)鍵的調(diào)控作用。既往文獻(xiàn)提示我們?nèi)A勒變性早期IL-1p在周?chē)窠?jīng)中表達(dá)升高,而此階段又恰是施旺細(xì)胞去分化及增殖的重要時(shí)段,同時(shí)IL-1p在其他細(xì)胞模型的研究中又可通過(guò)c-Jun/AP-1通路促進(jìn)成熟細(xì)胞去分化。由此,我們猜測(cè)IL-1p在外周神經(jīng)損傷再生修復(fù)過(guò)程中對(duì)施旺細(xì)胞去分化、增殖及凋亡具有重要的調(diào)控作用,并且可能是通過(guò)c-Jun等相關(guān)通路發(fā)揮作用。既往研究外周神經(jīng)損傷后華勒變性主要集中在體內(nèi)模型中,體內(nèi)模型中對(duì)華勒變性的影響因素眾多,而單純的體外培養(yǎng)施旺細(xì)胞原代,使得施旺細(xì)胞脫離了神經(jīng)軸索對(duì)其的影響,也很難真實(shí)反映干預(yù)因素對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)中施旺細(xì)胞的影響。因此本研究應(yīng)用外周神經(jīng)華勒變性體外模型,該模型主要是參照Thomson et al.于1993報(bào)道的體外華勒氏變性模型(in-vitro Wallerian Degeneration model),模型中施旺細(xì)胞可表現(xiàn)出與體內(nèi)華勒氏變性模型中相似的MPZ等髓鞘化相關(guān)基因表達(dá)降低,而p75NTR等非髓鞘化相關(guān)基因表達(dá)升高。該模型后經(jīng)Lee, H. K. et al.采用并改進(jìn),應(yīng)用于Proteasome抑制施旺細(xì)胞去分化的研究。以及Jung, J. et al.和Shin, Y. K. et al.采用,同樣也是用于研究華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞去分化的影響因素。由此,可見(jiàn)體外華勒氏變性模型具有較好可靠性。因此,我們采用該體外華勒氏變性模型,并根據(jù)需要做了改進(jìn),以研究IL-1p對(duì)施旺細(xì)胞的影響,重點(diǎn)關(guān)注華勒變性早期IL-1p對(duì)施旺細(xì)胞去分化、增殖及凋亡影響,并研究探討相關(guān)的作用機(jī)制,希望以此為窗口來(lái)探尋局部組織損傷后炎癥因子對(duì)成體細(xì)胞去分化及組織再生的影響。二、研究目的通過(guò)改進(jìn)后的大鼠坐骨神經(jīng)體外華勒氏變性模型,進(jìn)一步確認(rèn)該模型的可靠性,并以該模型為基礎(chǔ),研究外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性早期施旺細(xì)胞IL-1p的表達(dá)情況,以及IL-1p對(duì)施旺細(xì)胞去分化、增殖及凋亡影響,并研究探討相關(guān)的作用機(jī)制,希望以此為窗口來(lái)探尋局部組織損傷后炎癥因子對(duì)成體細(xì)胞去分化及組織再生的影響。三、研究方法1.體外華勒氏變性模型的制備及分組干預(yù)體外華勒氏變性模型的制備方法主要是參照Thomson et al.于1993報(bào)道的vitro Wallerian degeneration model制備方法,并根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)進(jìn)行了改進(jìn)。即將去除神經(jīng)外膜的大鼠坐骨神經(jīng)分成絮狀神經(jīng)絲后體外組織培養(yǎng)。離體后的坐骨神經(jīng)組織即開(kāi)始發(fā)生華勒氏變性,并且此模型中的主要細(xì)胞成分只有施旺細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?給予體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1p干預(yù),并于不同時(shí)間點(diǎn)收集樣本。2. Real time PCR測(cè)定體外華勒氏變性模型中不同時(shí)間點(diǎn)(6 H、12H、24H)施旺細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量。3. Elisa測(cè)定體外華勒氏變性模型中不同時(shí)間點(diǎn)(12H、24H、36H、48H)施旺細(xì)胞IL-1p蛋白的表達(dá)量。4.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0ng/ml、5ng/ml和50ng/ml)48小時(shí)后,免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞去分化指標(biāo)p75NTR和分化指標(biāo)MPZ,并且Western Blot分別檢測(cè)并量化比較p75NTR和MPZ蛋白表達(dá)量。5.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml(對(duì)照組)或5ng/ml IL-1β干預(yù)后,Real time PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6 H、12 H、24 H)去分化指標(biāo)p75NTR和分化指標(biāo)MPZ mRNA表達(dá)量。6.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)24小時(shí),免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-Jun,并統(tǒng)計(jì)比較c-Jun陽(yáng)性率；Western Blot檢測(cè)進(jìn)一步量化比較轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)量差異。7.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml(對(duì)照組)或5ng/ml IL-1β干預(yù)后,Real time PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6 H、12 H、24 H)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun mRNA表達(dá)量。8.體外華勒氏變性模型中0 ng/ml(對(duì)照組)或5ng/ml IL-1β干預(yù)后,AP-1activity assay檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6 H、12 H、24H)核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(AP-1)的活性相對(duì)值。9.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1p干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)48小時(shí),免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67,并統(tǒng)計(jì)比較Ki67陽(yáng)性率(即細(xì)胞增殖率)。10.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)48小時(shí),Tunel法染色標(biāo)記施旺細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況,并統(tǒng)計(jì)各組Tunel陽(yáng)性率(即細(xì)胞凋亡率)。11.體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1p干預(yù)(0ng/ml和5ng/ml)24小時(shí),Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡促進(jìn)蛋白Bax和細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)量,統(tǒng)計(jì)比較Bcl-2和Bax表達(dá)量以及Bcl-2/Bax比值。12.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(mean±SD),每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次(n=3)。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；兩樣本均數(shù)間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOV A),如有顯著性差異,且方差齊性,則采用LSD(Least Significant Difference)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、結(jié)果1.體外華勒氏變性模型中施旺細(xì)胞IL-1βmRNA和IL-1p蛋白表達(dá)量變化去除神經(jīng)外膜的大鼠坐骨神經(jīng)組織離體后置于體外華勒氏變性模型中進(jìn)行培養(yǎng),于不同時(shí)間點(diǎn)收集樣本。Real time PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6H、12H、24H)施旺細(xì)胞IL-1βmRNA表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果采用單因素方差分析,F=24.384,p0.001；Elisa檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(12 H、24 H、36H、8H)施旺細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)量,檢測(cè)結(jié)果采用單因素方差分析,F=169.261,p0.001；且方差齊性,隨后LSD法檢驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組OH之間的表達(dá)差異,大鼠坐骨神經(jīng)受損離體后華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞IL-1βmRNA和IL-1β蛋白表達(dá)量逐漸增高,IL-1βmRNA于12小時(shí)較對(duì)照組升高了近7倍達(dá)到高峰期,隨后開(kāi)始有所降低；IL-1β蛋白分泌量逐漸增高,于36小時(shí)較對(duì)照組升高了近4倍達(dá)到高峰期,隨后開(kāi)始有所降低。2.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中p75NTR和MPZ表達(dá)情況給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml、5 ng/ml和50ng/ml)48小時(shí),免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞去分化指標(biāo)p75NTR和分化指標(biāo)MPZ。觀察顯示,5ng/ml IL-1β干預(yù)后施旺細(xì)胞去分化指標(biāo)p75NTR表達(dá)量較0ng/ml組有所升高,施旺細(xì)胞分化指標(biāo)MPZ表達(dá)量較0ng/ml組有所降低；而50ng/ml IL-1β干預(yù)后,p75NTR和MPZ表達(dá)量較0 ng/ml組差異并不顯著；Western Blot檢測(cè)量化比較不同濃度組p75NTR和MPZ表達(dá)量差異(單因素方差分析,p75NTR檢測(cè)結(jié)果中F=9.620, p=0.013; MPZ檢測(cè)結(jié)果中F=9.604,p=0.013；且統(tǒng)計(jì)顯示方差齊性,隨后LSD法檢驗(yàn)不同濃度組與對(duì)照組0 ng/ml之間的表達(dá)差異),5 ng/ml濃度組較對(duì)照組0 ng/ml中p75NTR表達(dá)量顯著升高(p=0.008),MPZ表達(dá)量顯著降低(p=0.005)；50ng/ml濃度組較對(duì)照組0 ng/ml中p75NTR以及MPZ表達(dá)量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blot檢測(cè)與免疫熒光染色結(jié)果一致。3.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中p75NTR和MPZ mRNA表達(dá)情況予體外華勒氏變性模型中0 ng/ml(對(duì)照組)或5ng/ml IL-1β干預(yù)后,于不同時(shí)間點(diǎn)(6H、12H、24H)收集樣本, Real time PCR檢測(cè)p75NTR和MPZ mRNA表達(dá)量,檢測(cè)所得結(jié)果采用兩樣本Student t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)5 ng/ml干預(yù)組與對(duì)照組之間p75NTR和MPZ mRNA表達(dá)量的差異,檢測(cè)結(jié)果顯示p75NTR mRNA表達(dá)量隨著時(shí)間推移逐漸升高,5 ng/ml干預(yù)組p75NTR mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高,干預(yù)6小時(shí)后干預(yù)組p75NTR mRNA表達(dá)量較對(duì)照組升高了近5倍(t=-17.642,p0.001),干預(yù)12H和24H后,5ng/ml IL-1β干預(yù)組p75NTR mRNA表達(dá)量較對(duì)照組均升高了近2.5倍(兩組t值分別為-8.578和-9.053,p0.001); MPZ mRNA表達(dá)量隨著時(shí)間推移逐漸降低,5 ng/ml干預(yù)組MPZmRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。干預(yù)后的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6H、12H、24H)5ng/mlIL-1β干預(yù)組MZP mRNA表達(dá)量較對(duì)照組降低約50%(6H VS OH, t=6.416, p=0.0030.01; 12H VS OH,t=5.556,p=0.0050.01;24H VS OH,t=7.913,p0.001), Real time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中施旺細(xì)胞p75NTR mRNA表達(dá)量顯著升高,而MPZ mRNA表達(dá)量顯著降低。4.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)情況給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)24小時(shí),免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-Jun,觀察可見(jiàn)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun均主要位于細(xì)胞核內(nèi),即均處于其功能部位,5 ng/ml干預(yù)組轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)量較0 ng/ml組有所升高；量化比較兩組之間施旺細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun陽(yáng)性率,5 ng/ml干預(yù)組轉(zhuǎn)錄因子c-Jun陽(yáng)性率較0 ng/ml組顯著升高(t=-3.868,p=0.018)。Western Blot檢測(cè)進(jìn)一步量化比較IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)量差異,分析顯示5 ng/ml干預(yù)組轉(zhuǎn)錄因子c-Jun蛋白表達(dá)量較0 ng/ml組顯著升高(t=-4.508,p=0.011)。Western Blot檢測(cè)與免疫熒光染色結(jié)果一致,證實(shí)了,適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可促進(jìn)坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)。5.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中c-Jun mRNA表達(dá)情況予體外華勒氏變性模型中0 ng/ml(對(duì)照組)或5 ng/ml IL-1β干預(yù)后,于不同時(shí)間點(diǎn)(6 H、12 H、24 H)收集樣本,Real time PCR檢測(cè)IL-1p干預(yù)后體外華勒氏變性模型中c-Jun mRNA表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析于不同時(shí)間點(diǎn)(6 H、12 H、24 H)內(nèi)5ng/ml IL-1β干預(yù)組與對(duì)照組之間c-Jun mRNA表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示,去除神經(jīng)外膜的坐骨神經(jīng)離體后于體外華勒氏變性模型中c-Jun mRNA表達(dá)量隨著時(shí)間推移逐漸升高,5 ng/ml干預(yù)組較對(duì)照組顯著升高,干預(yù)6小時(shí)后,5ng/ml IL-1β干預(yù)組c-Jun mRNA表達(dá)量較對(duì)照組升高約150%,且統(tǒng)計(jì)差異顯著(t=-8.733,p0.001)；干預(yù)12小時(shí)和24小時(shí)后,5ng/ml IL-1β干預(yù)組c-Jun mRNA表達(dá)量較對(duì)照組均升高約50%,且統(tǒng)計(jì)差異顯著(12小時(shí)組t=-3.498,p=0.025；24小時(shí)組t=-3.716,p=0.022). Real time PCR基因水平檢測(cè)結(jié)果與Western Blot、免疫熒光染色的蛋白水平檢測(cè)結(jié)果一致。可見(jiàn),適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可促進(jìn)坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá)。6.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中AP-1的活性變化情況予體外華勒氏變性模型中0 ng/ml(對(duì)照組)或5ng/ml IL-1β干預(yù)后,于不同時(shí)間點(diǎn)(6 H、12 H、24 H)收集樣本,AP-1 activity assay檢測(cè)IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1 (activation pmtein, AP-1)的活性相對(duì)值。檢測(cè)所得結(jié)果采用兩樣本Student t檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)分析于不同時(shí)間點(diǎn)(6 H、12 H、24 H)內(nèi)5 ng/ml IL-1β干預(yù)組與對(duì)照組之間AP-1活性差異。結(jié)果顯示,去除神經(jīng)外膜的坐骨神經(jīng)離體后于體外華勒氏變性模型中AP-1的活性隨著時(shí)間推移逐漸升高,5 ng/ml干預(yù)組較對(duì)照組升高更加顯著,干預(yù)6小時(shí)后,5 ng/ml IL-1β干預(yù)組AP-1的活性較對(duì)照組升高約20%,然而統(tǒng)計(jì)差異并不顯著(t=-1.359,p=0.246)；干預(yù)12小時(shí)后,5 ng/ml IL-1β干預(yù)組AP-1的活性較對(duì)照組升高約50%,統(tǒng)計(jì)差異顯著(t=-4.529,p=0.011)；干預(yù)24小時(shí)后,5 ng/ml IL-1β干預(yù)組AP-1的活性較對(duì)照組升高約80%,統(tǒng)計(jì)差異顯著(t=-3.952,p=0.017)�？梢�(jiàn),適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β不僅促進(jìn)坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達(dá),而且增加華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞AP-1的活性。7.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67表達(dá)情況給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)48小時(shí),免疫熒光染色標(biāo)記施旺細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67,觀察可見(jiàn)Ki67均主要位于細(xì)胞核內(nèi),且5 ng/ml干預(yù)組Ki67表達(dá)量較0 ng/ml組有所升高；量化比較兩組之間施旺細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)Ki67陽(yáng)性率,5 ng/ml干預(yù)組Ki67陽(yáng)性率較0 ng/ml組顯著升高(t=-6.264,p=0.003)。免疫熒光染色顯示,適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可促進(jìn)坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞的增殖。8.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中細(xì)胞凋亡情況給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)'48小時(shí),Tunel法染色標(biāo)記施旺細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況,并統(tǒng)計(jì)各組Tunel陽(yáng)性率(即細(xì)胞凋亡率)的差異,顯示5 ng/ml干預(yù)組凋亡率較0 ng/ml組顯著降低(t=4.274,p=0.013)。Tunel法細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示,適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可抑制坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞的凋亡。9.IL-1β干預(yù)后體外華勒氏變性模型中Bax和Bcl-2表達(dá)情況給于體外華勒氏變性模型不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)24小時(shí),Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡促進(jìn)蛋白Bax和細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)量,顯示5 ng/ml濃度組較對(duì)照組0 ng/ml中施旺細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高(t=-3.456,p=0.026),凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)量顯著降低(t=3.052,p=0.038),且Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)量比例顯著升高(t=-4.397,p=0.012)。這與Tunel法凋亡細(xì)胞染色結(jié)果一致�？梢�(jiàn),適當(dāng)濃度(5 ng/ml) IL-1β可增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)量,降低凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)量,從而抑制坐骨神經(jīng)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞凋亡。五、結(jié)論本實(shí)驗(yàn)研究顯示,體外華勒氏變性模型是研究周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)華勒氏變性過(guò)程中干預(yù)施旺細(xì)胞去分化影響因素的有效模型。通過(guò)該模型,我們研究進(jìn)一步證實(shí)華勒氏變性早期施旺細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量升高,IL-1β蛋白分泌量增多,華勒氏變性可視為外周神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)神經(jīng)損傷的固有免疫反應(yīng)。通過(guò)該模型給予相應(yīng)干預(yù),我們研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的IL-1β具有促進(jìn)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞去分化的作用,以及促進(jìn)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞清除髓鞘碎片,從而促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生,而過(guò)高濃度的IL-1β對(duì)華勒氏變性過(guò)程中施旺細(xì)胞去分化以及髓鞘碎片的清除并無(wú)促進(jìn)作用。本研究證實(shí)華勒氏變性早期適當(dāng)濃度的IL-1β具有促進(jìn)施旺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-Jun mRNA表達(dá)量,以及促進(jìn)施旺細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的高表達(dá),并促進(jìn)施旺細(xì)胞內(nèi)AP-1活化；并認(rèn)為華勒氏變性早期IL-1β通過(guò)c-Jun/AP-1通路促進(jìn)施旺細(xì)胞去分化,以及促進(jìn)施旺細(xì)胞清除髓鞘碎片,從而促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生。本研究證實(shí)華勒氏變性早期適當(dāng)濃度的IL-1β具有促進(jìn)施旺細(xì)胞增殖,以及增加Bcl-2表達(dá)量,減低Bax表達(dá)量,升高Bcl-2/Bax比值,抑制施旺細(xì)胞凋亡的積極作用；并認(rèn)為IL-1β通過(guò)促進(jìn)c-Jun/AP-1通路活化促進(jìn)施旺細(xì)胞增殖,通過(guò)Bcl-2/Bax通路抑制施旺細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：周?chē)窠?jīng) 再生醫(yī)學(xué) 華勒氏變性 施旺細(xì)胞 IL-1β p75NTR MPZ去分化 細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡 c-Jun AP-1 Ki67 Bcl-2 Bax
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R622
【目錄】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-25
• 第一章 外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性中IL-1β對(duì)施旺細(xì)胞去分化的影響25-64
• 前言25-29
• 1. 材料與方法29-40
• 2. 結(jié)果40-53
• 3. 討論53-57
• 4. 結(jié)論57
• 參考文獻(xiàn)57-64
• 第二章 外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性中IL-1β促進(jìn)施旺細(xì)胞去分化的作用機(jī)制研究64-89
• 前言64-65
• 1. 材料與方法65-73
• 2. 結(jié)果73-82
• 3. 討論82-85
• 4 結(jié)論85
• 參考文獻(xiàn)85-89
• 第三章 外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性中IL-1β對(duì)施旺細(xì)胞增殖及凋亡的影響89-113
• 前言89-90
• 1. 材料與方法90-95
• 2. 結(jié)果95-103
• 3. 討論103-107
• 4. 結(jié)論107
• 參考文獻(xiàn)107-113
• 附錄113-114
• 成果114-115
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明115-116
• 致謝116-117

  本文關(guān)鍵詞：IL-1β對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)華勒變性中施旺細(xì)胞的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：368016