本文關(guān)鍵詞：乳腺癌中wnt5a的表達(dá)及其對(duì)wnt經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Wnt (wingless-type MMTV integration site family)蛋白家族包括至少19個(gè)成員,是一組富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白,參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖分化甚至腫瘤發(fā)生等多個(gè)生物進(jìn)程。依據(jù)其不同功能,wnt信號(hào)通路可分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路,其中經(jīng)典通路具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力,對(duì)其研究已較廣泛。經(jīng)典wnts主要通過(guò)β-連接素(β-Catenin)/T細(xì)胞因子(T cell factor, TCF)介導(dǎo)wnt靶基因的激活,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增殖,該途徑成員有wnt1, wnt2, wnt3, wnt3a, wnt8等;另2條非經(jīng)典通路為β-Catenin非依賴性的wnt/極性通路和wnt/Ca2+通路,通常不具備細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力,其成員包括wnt4, wnt5a, wnt5b, wnt7b, wnt11等。Wnt信號(hào)途徑不僅直接控制著大量生長(zhǎng)、代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平,還通過(guò)與其它信號(hào)通路之間復(fù)雜的相互作用間接影響著一系列下游基因的表達(dá)。由此,wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控,包括胚胎生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)育、干細(xì)胞功能維持、能量代謝的平衡以及組織穩(wěn)定,而其失調(diào)則常與人類重大疾病相關(guān)。正常情況下,胞漿內(nèi)的β-Catenin與糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)、腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)、軸蛋白(Axin)形成復(fù)合物后,進(jìn)入遍在蛋白降解途徑,使β-Catenin維持較低水平。Wnt/p-Catenin經(jīng)典途徑中,wnt1、3a等與七次跨膜的卷曲蛋白家族受體(Frizzled, Fzd)及單次跨膜的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6, LRP5/6)結(jié)合,進(jìn)而募集Dv1、axin-GSK3,后者使LRP5/6磷酸化。磷酸化的LRP5/6可抑制β-Catenin/APC/Axin復(fù)合物的形成,β-Catenin不被遍在蛋白降解,則胞漿β-Catenin水平升高,進(jìn)而入核結(jié)合TCF并激活一系列基因的轉(zhuǎn)錄,即激活wnt/β-Catenin經(jīng)典途徑。β-Catenin/TCF可介導(dǎo)c-myc、cyclin D1、MMP7等一系列wnt靶基因的激活,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增殖。Wnt經(jīng)典途徑異常活化已被公認(rèn)為癌癥發(fā)生的重要標(biāo)志,腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移即常與β-Catenin途徑異常激活有關(guān)。除wnt蛋白作用外,若APC、 Axin及CTNNB1(編碼β-Catenin蛋白)等基因發(fā)生突變,亦可阻礙β-Catenin/APC/Axin復(fù)合物形成,使P-Catenin穩(wěn)定性提高,進(jìn)而激活wnt/β-Catenin信號(hào)通路。這些相關(guān)基因突變已被證實(shí)為人類腫瘤中的常見(jiàn)事件。然而,乳腺癌中這些基因均罕見(jiàn)突變。同時(shí),已有多項(xiàng)研究證實(shí)wnt/β-Catenin途徑在乳腺癌中亦異常活化,而該途徑異�；罨臋C(jī)制則尚未清楚。Wnt5a是wnt非經(jīng)典途徑的重要成員,經(jīng)與Frz受體結(jié)合發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用,參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程中的細(xì)胞間信號(hào)傳遞。Wnt5a雙突變Wnt-5a-/-鼠胚胎不能存活,且呈斷肢、面部畸形等多種發(fā)育缺陷,提示其在發(fā)育過(guò)程中的重要性。然而,由于wnt5a不具備細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力,對(duì)該基因的研究與wnt經(jīng)典途徑成員相比較少,其信號(hào)傳導(dǎo)途徑尚未完全闡明。除wnt/極性通路和wnt/Ca2+通路外,在某些條件下wnt5a也可以通過(guò)影響“經(jīng)典”信號(hào)通路而發(fā)揮作用,它可通過(guò)與不同受體結(jié)合,促進(jìn)或抑制wnt/β-Catenin經(jīng)典信號(hào)通路。Wnt5a在癌癥中的作用亦是直到最近才漸漸為人所知。研究指出wnt5a在細(xì)胞惡性進(jìn)展過(guò)程中具有關(guān)鍵作用,可因不同腫瘤型別而發(fā)揮促進(jìn)或抑制癌癥進(jìn)展的作用。在前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌及皮膚黑色素瘤組織中可檢測(cè)到wnt5a的高表達(dá),其被認(rèn)為具有癌基因潛質(zhì)；而在依賴β-Catenin經(jīng)典通路活化而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞惡性增殖的腫瘤中,wnt5a可通過(guò)抑制β-Catenin經(jīng)典通路而抑制癌癥發(fā)生發(fā)展。而在急性粒細(xì)胞白血病、結(jié)直腸癌以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤中wnt5a可能發(fā)揮生長(zhǎng)抑制活性,可以作為腫瘤抑制因子減少或延緩部分惡性腫瘤的發(fā)生及其轉(zhuǎn)移,并常因啟動(dòng)子高甲基化而沉默。Wnt5a在乳腺癌中的表達(dá)及作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)論。有研究發(fā)現(xiàn)wnt5a在非永生性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高,提示其屬于促癌基因的一種;亦有研究發(fā)現(xiàn)wnt5a在侵襲性乳腺導(dǎo)管癌中表達(dá)降低或缺如,并且其低表達(dá)與患者的早期復(fù)發(fā)及不良預(yù)后有關(guān),提示其發(fā)揮抑制癌癥進(jìn)展的作用。表觀遺傳學(xué)調(diào)控異�？墒鼓[瘤相關(guān)基因表達(dá)異常增高或降低,這在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中極為普遍。其中,因啟動(dòng)子甲基化而沉默是腫瘤形成過(guò)程中抑癌基因失活的關(guān)鍵機(jī)制。幾乎所有腫瘤類型中均存在多個(gè)抑癌基因由于CpG甲基化而失表達(dá)的情況。DNA啟動(dòng)子甲基化可以導(dǎo)致乳腺癌中多種抑癌基因失活,包括細(xì)胞周期調(diào)控基因、甾體類激素受體基因、細(xì)胞侵襲功能相關(guān)基因等,是促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。本研究擬明確wnt5a在乳腺癌中的表達(dá)情況及調(diào)控機(jī)制,并探討乳腺癌中wnt/β-Catenin途徑異�；罨目赡軝C(jī)制。本研究由兩部分組成。第一部分：探討wnt5a在乳腺癌中的表達(dá)情況、表達(dá)調(diào)控機(jī)制,并判斷其促癌或抑癌基因?qū)傩浴Ｊ占?008年2月至2009年10月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行乳腺癌根治術(shù)或改良根治術(shù)患者的新鮮乳腺癌標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本136對(duì),采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)wnt5a在乳腺癌及癌旁組織中的差異表達(dá),并以甲基化特異性PCR (methylation-specific PCR, MSP)、及亞硫酸鹽基因測(cè)序(bisulfite genomic sequencing, BGS)法檢測(cè)其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)；分析wnt5a表達(dá)及其與臨床、病理學(xué)特征之間的相關(guān)性,并對(duì)患者隨訪資料行生存分析,以期明確wnt5a在乳腺癌組織中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制,及其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。136對(duì)乳腺癌及相應(yīng)癌旁組織的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,乳腺癌組織中Wnt5a平均表達(dá)量?jī)H為癌旁組織的36.35%。乳腺癌中Wnt5a表達(dá)與組織學(xué)類型及腫瘤大小無(wú)關(guān),但隨腫瘤組織學(xué)等級(jí)升高而降低,且有在低齡或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)更低的傾向。在與其它病理學(xué)特征的關(guān)系方面,乳腺癌組織中Wnt5a表達(dá)量隨ER或PR表達(dá)升高而呈升高趨勢(shì),而與Ki67表達(dá)之間則呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)均支持乳腺癌中wnt5a作為抑癌基因的假設(shè)。采用針對(duì)wnt5a基因啟動(dòng)子區(qū)兩個(gè)區(qū)域的MSP檢測(cè)結(jié)果均顯示乳腺癌組織標(biāo)本中該基因甲基化程度高于相應(yīng)癌旁組織,同時(shí)BGS結(jié)果亦顯示乳腺癌組織標(biāo)本中該基因發(fā)生甲基化的位點(diǎn)多于癌旁組織標(biāo)本,提示乳腺癌組織中wnt5a基因表達(dá)下調(diào)是因啟動(dòng)子甲基化所導(dǎo)致。參考乳腺癌組織較癌旁組織標(biāo)本中wnt5a的平均相對(duì)表達(dá)量,將病例按照該相對(duì)表達(dá)量高低分為3組,采用Kaplan-Meier法進(jìn)行病例的生存分析,并以log-rank檢驗(yàn)比較不同wnt5a表達(dá)水平組的生存曲線。Kaplan-Meier分析得出wnt5a低、中、高表達(dá)組的5年生存率分別是67.74%(95% CI=48.34-81.36),82.43% (95% CI=68.93-90.45),94.08%(95% CI= 82.74-98.95)= Log-rank檢驗(yàn)提示三條曲線間存在顯著差異(χ2=9.934,P=0.007),且wnt5a表達(dá)與生存時(shí)間呈顯著線性相關(guān)(χ2=9.285,P=0.0023)。第二部分：探討乳腺癌中wnt/β-Catenin途徑異常激活以及wnt5a發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制。將外源性wnt5a導(dǎo)入該基因失表達(dá)的MCF-7細(xì)胞系,并設(shè)立失活wnt5a短基因?yàn)閷?duì)照,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,以檢測(cè)wnt5a對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;并以western blot檢測(cè)β-Catenin及下游分子c-myc、cyclin D1、 MMP7的表達(dá)情況,以檢測(cè)外源性wnt5a是否可以抑制wnt/β-Catenin經(jīng)典通路,進(jìn)而探討wnt/β-Catenin途徑在乳腺癌中異常激活以及wnt5a發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7給予外源性wnt5a后,MTT細(xì)胞增殖活性分析顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-wnt5a-SI的MCF-7細(xì)胞增殖不受影響,而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-wnt5a的MCF-7細(xì)胞增殖則有所降低,并在轉(zhuǎn)染后第三、四、五天顯著低于未轉(zhuǎn)染組及pcDNA3.1(+)-wnt5a-SI轉(zhuǎn)染組(P0.05)。western blot分析表明wnt5a轉(zhuǎn)染后β-Catenin表達(dá)降低,且其下游分子c-myc、cyclin D1、MMP7等表達(dá)水平亦下調(diào),提示wnt5a在乳腺癌中可能通過(guò)抑制wnt/β-Catenin途徑發(fā)揮抑癌作用,而wnt/β-Catenin途徑的異常活化則與wnt5a甲基化失活有關(guān)。本研究得出以下結(jié)論：(一)、Wnt5a在乳腺癌中表達(dá)下調(diào),且該下調(diào)與提示進(jìn)展型腫瘤類型的各種臨床特征具有相關(guān)性,支持Wnt5a在乳腺癌中作為腫瘤抑制基因的假設(shè)。(二)、表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與了wnt5a在乳腺癌中的表達(dá)調(diào)控,其在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)與啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)有關(guān)。(三)、在乳腺癌中wnt5a可能通過(guò)抑制wnt/β-Catenin途徑而抑制腫瘤細(xì)胞增殖及遷移,發(fā)揮抑癌作用。(四)、乳腺癌中wnt/β-Catenin途徑的異常激活與wnt5a沉默有關(guān)。(五)、由于表觀遺傳學(xué)調(diào)控具有可逆性,而乳腺癌中wnt/β-Catenin途徑的異常激活與wnt5a甲基化沉默有關(guān),故可以借助表觀遺傳學(xué)機(jī)制,將wnt信號(hào)途徑作為乳腺腫瘤的治療靶點(diǎn)。Wnt/β-Catenin經(jīng)典途徑異常激活是乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要事件。本研究證實(shí)wnt非經(jīng)典途徑成員wnt5a為乳腺癌的抑癌基因,其在乳腺癌細(xì)胞中的甲基化沉默則與該途徑的異常活化有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步闡明乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為乳腺癌的表觀遺傳學(xué)靶向治療提供有效理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺腫瘤 表觀遺傳學(xué) wnt5a β-Catenin 抑癌基因
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 符號(hào)說(shuō)明16-17
• 第一部分 Wnt5a在乳腺癌中的甲基化失活及其與臨床病理學(xué)特征關(guān)系的研究17-50
• 前言17-20
• 第一章 材料與方法20-30
• 第二章 結(jié)果30-38
• 第三章 討論38-43
• 參考文獻(xiàn)43-50
• 第二部分 乳腺癌中wnt5a通過(guò)wnt/β-Catenin經(jīng)典途徑發(fā)揮抑癌作用50-77
• 前言50-52
• 第一章 材料與方法52-57
• 第二章 結(jié)果57-59
• 第三章 討論59-65
• 參考文獻(xiàn)65-77
• 文獻(xiàn)綜述 乳腺癌表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展77-93
• 參考文獻(xiàn)85-93
• 致謝93-94
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況94-95
• 論文評(píng)閱及答辯情況表95-96
• 外文論文Ⅰ96-112
• 外文論文Ⅱ112-132

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉霞;Eb病毒相關(guān)胃癌腫瘤相關(guān)基因表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D];青島大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：乳腺癌中wnt5a的表達(dá)及其對(duì)wnt經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：367967