本文關(guān)鍵詞：紅花多糖對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[背景]乳腺癌是女性中發(fā)病率最高而死亡率僅低于肺癌的、嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤,每年全世界有超過(guò)130萬(wàn)女性新診斷為乳腺癌,約50多萬(wàn)女性死于乳腺癌。隨著生活方式的急劇變化和生態(tài)環(huán)境的急劇惡化,我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)比較明顯的上升趨勢(shì),每年有高達(dá)3-4%的新增病例,成為了我國(guó)發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一,而且有呈年輕化的趨勢(shì),我國(guó)女性乳腺癌病人的發(fā)病中位年齡約比西方提前了十年。因此,闡述乳腺癌發(fā)病機(jī)制,控制乳腺癌發(fā)生率,提高乳腺癌治療效果,降低乳腺癌死亡率己成為亟待解決的重大課題。外科手術(shù)是乳腺癌的公認(rèn)根治性治療手段,但單純手術(shù)無(wú)法有效改善乳腺癌患者預(yù)后,癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要因素。放化療可有效提高局部控制率,改善遠(yuǎn)期生存率,是乳腺癌臨床治療的重要輔助手段。但長(zhǎng)期放化療具有嚴(yán)重的毒副反應(yīng),并大大提高腫瘤組織的放化療抵抗作用,因此需探討更有效的輔助治療手段。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,在某些生理因素作用下,通過(guò)體內(nèi)外因素共同而引發(fā)的細(xì)胞自主的有序的死亡,該過(guò)程亦被稱(chēng)為細(xì)胞程序性死亡。這是個(gè)井然有序的過(guò)程,并不是病理?xiàng)l件下地?fù)p傷現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同,細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過(guò)程,而是主動(dòng)過(guò)程,它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡在機(jī)體維持自身動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。發(fā)生凋亡的細(xì)胞大多數(shù)是生物個(gè)體中多余或老化的細(xì)胞,也有可能是發(fā)生腫瘤時(shí)的細(xì)胞或受到病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞。許多情況下,細(xì)胞凋亡是對(duì)來(lái)自其他細(xì)胞或循環(huán)境中的信號(hào)所作出的一種反應(yīng)。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是細(xì)胞過(guò)度增殖和細(xì)胞凋亡通路受阻共同作用的結(jié)果。細(xì)胞凋亡(apoptosis)及其在腫瘤發(fā)生和治療中的作用越來(lái)越受到關(guān)注,同時(shí)基于促腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)理的腫瘤生物治療也有重要進(jìn)展。細(xì)胞周期(cell cycle)是生命體一代向下一代傳遞的連續(xù)過(guò)程中最基本也是最重要的過(guò)程。該過(guò)程從細(xì)胞一次分裂完成開(kāi)始,到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束,其中DNA合成和細(xì)胞分裂是細(xì)胞周期的兩個(gè)重要階段,包含G1期、S期、G2期和M期。在物種的不斷進(jìn)化中,為了確保細(xì)胞周期嚴(yán)格遵循有序交替和各時(shí)相依次有序變更的生理過(guò)程,生命體細(xì)胞發(fā)展并建立了一系列的調(diào)控機(jī)制。當(dāng)受到機(jī)體內(nèi)外某些因素刺激而使調(diào)控細(xì)胞周期的分子網(wǎng)絡(luò)成員發(fā)生異常改變時(shí),細(xì)胞周期失調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞不協(xié)調(diào)地增生,DNA受損等異常情況,致使異常細(xì)胞不能凋亡,從而導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。由此可見(jiàn),細(xì)胞周期的失調(diào)和腫瘤的發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)。因此,細(xì)胞周期對(duì)認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生和演進(jìn)、臨床診斷與治療有十分重要的意義。中藥紅花(Safflower)又稱(chēng)紅藍(lán)花、草紅花,為菊科植物,是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材,其性溫,味辛,具有活血化瘀、通經(jīng)止痛之功效。紅花在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布,其中以新疆、四川等地最多。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),紅花中包含多種生物活性成分,如紅花多糖(Safflower polysaccharide)、黃酮類(lèi)(flavone)、紅花黃色素(Safflower yellow)、有機(jī)酸(Organic acid)、紅花苷(Safflower carthamin)等。大量研究顯示,紅花多糖具有多種藥理學(xué)活性,如抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、降血壓及免疫調(diào)節(jié)等。由于紅花多糖具有資源豐富、毒副作用小、安全性高、且易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì),受到廣泛關(guān)注。此外,紅花多糖與化療藥物聯(lián)用,具有增強(qiáng)其藥效、降低其毒副作用的輔助功能。前期研究證實(shí),紅花多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期,實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用,但其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚未明確。[目的]本研究旨在探討水提醇沉法提取紅花多糖的效果,以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象,探討紅花多糖體外對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響,并在此基礎(chǔ)上研究紅花多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響,以期為乳腺癌的臨床治療探索新的思路和方法,也為中藥多糖的臨床應(yīng)用的提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]第一部分：選取中藥紅花為原材料并以沸水煎煮,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所得藥液進(jìn)行濃縮,采用水提醇沉法提取粗多糖,之后經(jīng)反復(fù)凍融除去雜質(zhì)、Sevage法除蛋白、脫色、洗滌等步驟,最終獲得精制紅花多糖。采用硫酸-苯酚法測(cè)定所得精制紅花多糖中的多糖含量。用分析天平稱(chēng)取紅花多糖樣品20 mg于100mL容量瓶中,加入蒸餾水將其稀釋至刻度線,充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙�。用移液管精確量取紅花多糖溶液1.0 mL,并向其中加入1.0 mL雙蒸水、1.0 mL 6%苯酸以及5.0 mL濃硫酸。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度并根據(jù)回歸方程得出多糖的含量。第二部分：選取人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象,將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%時(shí)對(duì)其進(jìn)行分組、給藥并設(shè)立空白對(duì)照組和不同濃度的紅花多糖組(0.06mg/mL、0.12mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.00mg/mL、2.00 mg/mL)。待MCF-7細(xì)胞給藥后12h、24h、48h、和72h用倒置顯微鏡觀察各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量和形態(tài),并拍照記錄。采用MTT比色法對(duì)紅花多糖作用后MCF-7細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測(cè),采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其細(xì)胞周期和凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。第三部分：選取人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象,將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞MCF-7接種于培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含0.4%胎牛血清的RBMI 1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后加入不同濃度的紅花多糖(0.12mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.00mg/mL、 2.00 mg/mL),分別培養(yǎng)48h收集細(xì)胞。一部分用藥物處理后的乳腺癌MCF-7細(xì)胞提取總蛋白,用Western Blot法測(cè)定Bax、Bcl-2、p53蛋白的表達(dá)。另一部分用藥物處理后的乳腺癌MCF-7細(xì)胞用于提取總RNA,采用RT-PCR法,以β-actin為內(nèi)參基因,分析紅花多糖作用后的乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、p53基因的表達(dá)情況。應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的Ct值(Cycle threshold),用內(nèi)參基因β-actin對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理,以此分析各細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)變化情況。第四部分：選取乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤模型為研究對(duì)象,設(shè)立對(duì)照組和不同濃度的紅花多糖(0.12mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、 1.00mg/mL、2.00mg/mL)干預(yù)組,進(jìn)行連續(xù)14d的藥物干預(yù)治療。比較各組小鼠一般情況、體重、瘤重、瘤體積及抑瘤率。[結(jié)果]第一部分：450.16g生藥紅花經(jīng)水提醇沉,得到的紅花多糖為26.1g,多糖得率為5.79%。獲得的多糖溶于水后在蛋白質(zhì)、多肽和核酸的吸收峰260 nm和280 nm處無(wú)紫外吸收,說(shuō)明所得到的多糖純度較好,不含蛋白質(zhì)、多肽和核酸等雜質(zhì)。硫酸-苯酚法檢測(cè)結(jié)果顯示,上述所提取精制紅花多糖中紅花多糖的含量為91.2%。第二部分：正常生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞貼壁均勻生長(zhǎng),細(xì)胞呈典型的上皮樣貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞排列密集、整齊,輪廓清楚,多數(shù)細(xì)胞處于旺盛的生長(zhǎng)期和分裂期,死亡或者凋亡的細(xì)胞少。與正常癌細(xì)胞相比,經(jīng)紅花多糖作用后人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳,表現(xiàn)為細(xì)胞萎縮,形狀不規(guī)則,貼壁能力降低并見(jiàn)部分細(xì)胞漂浮,細(xì)胞核多見(jiàn)固縮,細(xì)胞間隙增大,核比例減小。上述現(xiàn)象具有時(shí)間和劑量依賴性。0.06 mg/mL～1.00mg/mL紅花多糖作用72時(shí),人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的生長(zhǎng)抑制率逐漸上升,并呈現(xiàn)較明顯的劑量依賴性。在1.00mg/mL紅花多糖濃度時(shí),抑制率最高,為75%；0.50mg/mL 與 1.00mg/mL紅花多糖濃度對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的抑制率沒(méi)有顯著性差異(P0.05)；但是當(dāng)濃度達(dá)到2.00mg/mL時(shí),紅花多糖對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率有所下降,且與1.00mg/mL紅花多糖組存在顯著性差異(P0.05)。根據(jù)不同濃度的紅花多糖對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況,用IC50計(jì)算軟件計(jì)算出紅花多糖用于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 72小時(shí)后半數(shù)抑制濃度IC50別為：0.4154mg/ml。在一定濃度范圍內(nèi),紅花多糖的抑制作用與多糖濃度和作用時(shí)間呈正比關(guān)系。紅花多糖濃度在0-1.00 mg/mL以內(nèi),作用于MCF-7在48h內(nèi),隨著紅花多糖濃度的增加,對(duì)MCF-7有顯著抑制(P0.05)；當(dāng)多糖濃度大于1.00mg/mL時(shí),MCF-7的抑制率沒(méi)有明顯的增加。當(dāng)紅花多糖濃度達(dá)到1.00 μg/mL,作用于MCF-7細(xì)胞48h時(shí),抑制率效果最好。紅花多糖在體外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞能顯著的誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡,且在一定濃度范圍內(nèi),其作用與紅花多糖濃度和作用時(shí)間的呈正比關(guān)系。紅花多糖濃度在0-1.00mg/mL時(shí),作用于MCF-7在48h內(nèi),隨著紅花多糖濃度的增加,能顯著的誘導(dǎo)MCF-7發(fā)生凋亡。當(dāng)紅花多糖濃度超過(guò)1.00mg/mL時(shí),MCF-7的抑制率無(wú)明顯增加。當(dāng)紅花多糖濃度達(dá)到1.00 mg/mL,作用于MCF-7 48h時(shí),誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率最高。隨著紅花多糖濃度增加,S期和G2期細(xì)胞相應(yīng)減少,而G1期細(xì)胞逐漸增多。在低濃度時(shí)(0.12,0.25 mg/mL),紅花多糖對(duì)G1期細(xì)胞數(shù)量無(wú)影響。當(dāng)紅花多糖濃度達(dá)到0.5mg/mL時(shí),G1期細(xì)胞的數(shù)量明顯增加(P0.05)。提示人乳腺癌細(xì)胞分裂增殖活動(dòng)因細(xì)胞周期停滯而減弱,大部分細(xì)胞都被阻滯在G1期。第三部分：本研究分別采用瓊脂糖凝膠電泳、分光光度法測(cè)定了RNA樣品的完整度、濃度和純度。經(jīng)分光光度計(jì)于260 nm和280nm波長(zhǎng)處測(cè)定RNA樣品的OD260/280比值均在1.8～2.0范圍內(nèi),同時(shí)根據(jù)OD260計(jì)算RNA樣品濃度,將RNA樣品的濃度調(diào)整至500 ng/μL；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,28S rRNA與18S rRNA的亮度比值約為2：1,說(shuō)明本研究所提取的RNA樣品質(zhì)量較好,未被降解。RT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2、p53mRNA的表達(dá)情況顯示,空白對(duì)照組和紅花多糖組作用48h后,Bax、Bcl-2、p53 mRNA在MCF-7細(xì)胞內(nèi)均有不同程度的表達(dá)。與對(duì)照組相比,經(jīng)1.00 mg/mL和2.00mg/mL紅花多糖作用48h后,Bax mRNA表達(dá)明顯增加,且具有顯著性差異(P0.05)；而0.12、0.25和0.5 mg/mL紅花多糖試驗(yàn)組,無(wú)顯著性差異(P0.05)；與空白組相比,0.25、0.50、1.00和2.00 mg/mL的四組紅花多糖實(shí)驗(yàn)組在經(jīng)過(guò)48h作用后后,細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA表達(dá)量均顯著增高,與空白組相比差異顯著(P0.050,僅0.12 mg/mL試驗(yàn)組無(wú)明顯差異(P0.05)。經(jīng)1.00、2.00 mg/mL紅花多糖作用48h后,Bcl-2 mRNA的表達(dá)量相較于空白組顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而0.12、0.25和0.50mg/mL紅花多糖試驗(yàn)組較空白組差異不顯著(P0.05)。本研究應(yīng)用Western blot法分析了Bax、Bcl-2和p53蛋白在紅花多糖作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞后的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在體外,紅花多糖能提高M(jìn)CF-7細(xì)胞對(duì)Bax和p53蛋白的表達(dá),抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。從圖4-2可以看出在濃度為1.00和2.OOmg/ml時(shí),能顯著的減少Bcl-2蛋白的表達(dá),Bax和p53顯著性的增加,這個(gè)結(jié)果與檢測(cè)mRNA表達(dá)量的結(jié)果一致。第四部分：對(duì)照組裸鼠食欲明顯下降、被毛凌亂、不同程度消瘦、反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)遲緩。各試驗(yàn)組裸鼠飲水、采食等生活質(zhì)量均未受到明顯影響,且精神狀態(tài)、反應(yīng)速度及行動(dòng)能力均優(yōu)于對(duì)照組。與對(duì)照組相比較,試驗(yàn)組各組體重、抑瘤率明顯提高,瘤重及瘤體積明顯降低,并呈明顯劑量依賴性,組間比較差異顯著(P0.05)。[結(jié)論]采用水提醇沉法制取紅花多糖,多糖產(chǎn)量高、純度好,并且具有簡(jiǎn)便可靠、穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高以及重現(xiàn)性好的特點(diǎn),可為紅花多糖的提取提供相關(guān)的技術(shù)支持,也為充分開(kāi)發(fā)和利用紅花資源提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。紅花多糖對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有顯著的抑制作用,且在一定范圍(1.00mg/ml,48h)之內(nèi),隨著紅花多糖濃度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)作用抑制作用越強(qiáng)。紅花多糖能把人乳腺癌細(xì)胞MCF-7阻滯于G1期,使細(xì)胞在該期發(fā)生調(diào)亡,且細(xì)胞凋亡程度與紅花多糖的濃度有關(guān)。紅花多糖作用于乳腺癌細(xì)胞MCF-7,可顯著上調(diào)p53mRNA 及 Bax mRNA的表達(dá)水平,下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)水平,而且這種調(diào)節(jié)作用存在濃度依賴關(guān)系。調(diào)節(jié)凋亡基因表達(dá)可能是紅花多糖發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機(jī)制之一。紅花多糖可有效改善乳腺癌MCF-7細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠生活質(zhì)量,抑制體重降低和腫瘤生長(zhǎng),且并未引發(fā)明顯毒性反應(yīng),具有較好的體內(nèi)抑瘤作用。
【關(guān)鍵詞】：紅花多糖 乳腺癌 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期 Bcl-2 p53
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-21
• 第一章 文獻(xiàn)綜述21-39
• 1.1 乳腺癌的危害21
• 1.2 腫瘤的發(fā)生機(jī)制21-22
• 1.3 腫瘤增殖與細(xì)胞凋亡22-23
• 1.4 細(xì)胞周期與腫瘤23-24
• 1.5 p53在抗癌中的作用24-25
• 1.6 Bax在抗癌中的作用25-26
• 1.7 Bcl-2在抗癌中的作用26-28
• 1.8 中藥抗腫瘤的研究現(xiàn)狀28-35
• 1.8.1 中藥能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡28-29
• 1.8.2 中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用29-30
• 1.8.3 中藥能抑制端粒酶活性30-31
• 1.8.4 中藥能調(diào)控原癌基因和抑癌基因的表達(dá)31-32
• 1.8.5 中藥能抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和抗侵襲作用32
• 1.8.6 中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞分化的誘導(dǎo)32-33
• 1.8.7 中藥能調(diào)節(jié)代謝33
• 1.8.8 中藥能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性33-34
• 1.8.9 中藥對(duì)腫瘤內(nèi)血管生長(zhǎng)的抑制34-35
• 1.8.10 中藥能減少化療對(duì)機(jī)體的副作用35
• 1.9 紅花在中藥中的作用35-36
• 1.10 紅花抗腫瘤作用的研究進(jìn)展36-37
• 展望37-39
• 第二章 紅花多糖的提純和鑒定39-45
• 引言39
• 1 材料39-40
• 2. 方法40-42
• 3. 結(jié)果與分析42-43
• 4. 討論43-45
• 第三章 紅花多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡和周期的影響45-72
• 引言45-46
• 1. 材料46-48
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法48-54
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-68
• 4. 討論68-70
• 小結(jié)70-72
• 第四章 紅花多糖對(duì)MCF-7細(xì)胞Bax、Bcl-2、p53基因和蛋白表達(dá)的影響72-89
• 引言72-73
• 1. 材料73-76
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法76-82
• 3. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)82
• 4. 結(jié)果82-86
• 5 討論86-88
• 小結(jié)88-89
• 第五章 紅花多糖對(duì)人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用89-93
• 引言89
• 1. 材料89-90
• 1.1 細(xì)胞系89-90
• 1.2 試驗(yàn)動(dòng)物90
• 2. 試驗(yàn)方法90
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)90
• 2.2 動(dòng)物模型建立及分組90
• 2.3 觀察指標(biāo)90
• 3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法90
• 4. 結(jié)果90-91
• 5. 討論91-92
• 小結(jié)92-93
• 參考文獻(xiàn)93-111
• 中英文縮略詞111-112
• 致謝112-114
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明114

  本文關(guān)鍵詞：紅花多糖對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：361664