本文關(guān)鍵詞：SD大鼠NPMSC和BMSC在體外誘導(dǎo)條件下向軟骨細胞分化能力的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著下腰痛的發(fā)病率越來越高,治療這種疾病已經(jīng)成為當今社會界面臨的一個醫(yī)療和社會難題。研究發(fā)現(xiàn)下腰痛是由許多原因造成的,包括外傷,椎間盤退變,椎間盤突出,椎管狹窄等。而椎間盤退變被認為是下腰痛的主要原因。椎間盤退變表現(xiàn)為:髓核細胞和細胞外基質(zhì)的減少,椎間盤結(jié)構(gòu)的破壞。許多因素包括:基因、不良生活習慣、重體力勞動和其他的身體機能紊亂等都可能導(dǎo)致椎間盤退變。目前的治療椎間盤退變方法有:藥物治療、類固醇注射、理療、椎間盤切除、脊柱融合術(shù)等。這些方法只能減輕臨床癥狀,還不能治愈和阻止椎間盤退變的過程。因此,提出來許多新的治療和逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的方法。這些方法集中在修復(fù)再生髓核細胞,并取得了一定的研究進展。第一種新療法是分子治療,利用基因產(chǎn)物調(diào)控合成代謝和降解途徑從而抑制或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。第二種新療法是細胞治療,結(jié)合組織工程技術(shù),通過恢復(fù)或更換退變椎間盤中減少和衰老的髓核細胞來達到治療的目的。目前用到的種子細胞有從骨髓、脂肪、臍帶等組織提取出來的干細胞,還有同源性軟骨細胞和髓核細胞等。最近Blanco報道從退變椎間盤組織中分離培養(yǎng)出一些細胞,以骨髓間充質(zhì)干細胞為對照,發(fā)現(xiàn)這類細胞表達干細胞表面標志物CD44、CD29、CD90、CD73、CD105、CD166、CD106,不表達造血干細胞標志物CD34、CD45、CD14、CD19,并與骨髓間充質(zhì)干細胞標志物表達無明顯不同,并且具有成骨、成軟骨的分化能力,而無成脂分化能力。符合國際細胞治療學會(the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy,ISCT)中有關(guān)多能間充質(zhì)干細胞的界定標準。從髓核分離的干細胞,來源于髓核組織,相對于其他組織來源的干細胞更能適應(yīng)椎間盤的內(nèi)環(huán)境。但髓核干細胞和骨髓干細胞在細胞形態(tài)、增值能力、成骨成脂成軟骨分化能力上有什么區(qū)別,還沒有相關(guān)文獻報道。本實驗從SD大鼠的髓核組織中提取了髓核干細胞,并進行培養(yǎng)鑒定。比較髓核干細胞和骨髓干細胞形態(tài),增值能力和分化能力。比較髓核干細胞和骨髓干細胞在體外誘導(dǎo)條件下成軟骨能力有何區(qū)別。本實驗共分為三部分:第一部分NPMSC的分離培養(yǎng)鑒定目的:本部分實驗從SD大鼠髓核組織中分離和培養(yǎng)髓核干細胞,并通過細胞形態(tài)、干細胞基因、干細胞表面標記物,以及成骨、成脂、成軟骨分化能力進行鑒定。材料和方法:1.實驗動物選用由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供體重250±10g的健康雄性SD大鼠。2.實驗方法 2.1 NPMSC分離培養(yǎng)在無菌條件下應(yīng)用顯微鏡從每個SD大鼠尾巴的椎間盤內(nèi)分離髓核組織。經(jīng)過0.2%II型膠原酶和0.25%胰蛋白酶處理后,用含有20%胎牛血清和青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。2.2 NPMSC細胞形態(tài)觀察NPMSC培養(yǎng)到第三代進行細胞形態(tài)學觀察。2.3 PCR檢測NPMSC干細胞基因檢測收集第三代NPMSC應(yīng)用Trizol提取總RNA。PCR檢測Nanog、Sox2、Oct-4干細胞基因的表達。2.4 PCR檢測NPMSC干細胞表面標記物檢測PCR檢測CD44、CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、HLA-DR干細胞表面標記物的表達。2.5 NPMSC成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化NPMSC在體外誘導(dǎo)條件下向骨、脂肪、軟骨分化。觀察NPMSC的多向分化能力。結(jié)果:1.SD大鼠髓核組織中可以分離培養(yǎng)NPMSC。2.第三代NPMSC形態(tài)基本保持一致為紡錘樣長梭形。3.NPMSC表達干細胞基因Nanog、Sox2、Oct-4。4.NPMSC表達干細胞表面標記物CD44、CD105、CD73、CD90,不表達造血干細胞表面標記物CD45、CD34、CD14、HLA-DR。5.NPMSC具有成骨、成脂、成軟骨多向分化能力。結(jié)論一:從SD大鼠的髓核組織中可以分離培養(yǎng)出紡錘樣長梭形細胞,表達干細胞基因Nanog、Sox2、Oct-4,表達干細胞表面標記物CD44、CD105、CD73、CD90,不表達造血干細胞表面標記物CD45、CD34、CD14、HLA-DR,具有成骨、成脂、成軟骨多向分化能力的NPMSC。第二部分NPMSC和BMSC增殖能力和多向分化能力的比較目的：分離培養(yǎng)SD大鼠NPMSC和BMSC,比較兩種干細胞形態(tài)、細胞增殖能力、干細胞基因表達、干細胞表面標記物表達、成骨成脂成軟骨分化能力,以及誘導(dǎo)后成骨、成脂、成軟骨基因的表達。材料和方法:1.實驗動物選用由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供體重250±10g的健康雄性SD大鼠。2.實驗方法 2.1 NPMSC和BMSC分離培養(yǎng)分別從SD大鼠的椎間盤髓核組織和長骨骨髓中分離培養(yǎng)NPMSC和BMSC。2.2 NPMSC和BMSC細胞形態(tài)觀察NPMSC、BMSC培養(yǎng)到第三代進行細胞形態(tài)學觀察。2.3 NPMSC和BMSC細胞增殖能力檢測應(yīng)用CCK-8法分別檢測第三代NPMSC和BMSC在第0、1、3、5、7、9天的細胞增殖能力。2.4 PCR檢測NPMSC和BMSC干細胞基因檢測收集第三代NPMSC、BMSC應(yīng)用Trizol提取總RNA。PCR檢測Nanog、Sox2、Oct-4干細胞基因的表達。2.5 PCR檢測NPMSC和BMSC干細胞表面標記物檢測PCR檢測第三代NPMSC和BMSC中CD44、CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、HLA-DR干細胞表面標記物的表達。2.6 NPMSC和BMSC成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化NPMSC、BMSC在體外誘導(dǎo)條件下向骨、脂肪、軟骨分化。觀察NPMSC、BMSC的多向分化能力。2.7 PCR檢測NPMSC和BMSC成骨、成脂、成軟骨基因的表達PCR檢測NPMSC和BMSC誘導(dǎo)后成骨、成脂、成軟骨基因的表達。結(jié)果:1.SD大鼠髓核組織和骨髓中分離培養(yǎng)NPMSC和BMSC。2.第三代NPMSC和BMSC形態(tài)基本一致均為紡錘樣長梭形。3.第三代NPMSC和BMSC在增殖能力上相近。4.NPMSC和BMSC均表達干細胞基因Nanog、Sox2、Oct-4。5.NPMSC和BMSC表達干細胞表面標記物CD44、CD105、CD73、CD90,不表達造血干細胞表面標記物CD45、CD34、CD14、HLA-DR。6.NPMSC和BMSC具有成骨、成脂、成軟骨多向分化能力。7.NPMSC和BMSC誘導(dǎo)后均表達成骨、成脂、成軟骨基因。結(jié)論二:SD大鼠髓核組織中分離培養(yǎng)的NPMSC和長骨骨髓中分離培養(yǎng)的BMSC在細胞學形態(tài)、增殖能力上一致,均表達干細胞基因,表達干細胞表面標記物,不表達造血干細胞表面標記物,具有成骨、成脂、成軟骨能力,誘導(dǎo)后表達成骨、成脂、成軟骨基因。第三部分NPMSC和BMSC成軟骨能力的比較目的:應(yīng)用PCR、RT-PCR、Western-blotting等方法檢測NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因和蛋白表達。比較兩種干細胞在成軟骨能力上的差異。材料和方法:1.實驗動物選用由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供體重250±10g的健康雄性SD大鼠。2.實驗方法 2.1 NPMSC和BMSC在體外誘導(dǎo)條件下向軟骨細胞分化三代干細胞2.5×105個離心后,加入1ml新鮮的完全成軟骨誘導(dǎo)液(1ml不完全成軟骨誘導(dǎo)液+10μTGF-?3),在成軟骨誘導(dǎo)第21 d的時候,收集細胞。2.2 PCR檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因的表達分別提取NPMSC和BMSC誘導(dǎo)前后細胞的總RNA,應(yīng)用PCR檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因的表達。2.3 RT-PCR檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因的表達分別提取NPMSC和BMSC誘導(dǎo)前后細胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用RT-PCR定量檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因的表達。2.4 Western-blotting檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9蛋白的表達分別提取NPMSC和BMSC誘導(dǎo)前后細胞的總蛋白,應(yīng)用Western-blotting定量檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9蛋白的表達結(jié)果:1.NPMSC和BMSC在體外誘導(dǎo)條件下均可以向軟骨分化。2.NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后PCR檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因表達均增高,兩者之間表達無差異。3.NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后RT-PCR定量檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因表達均增高,兩者之間表達無差異。4.NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后Western-blotting定量檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9蛋白表達均增高,兩者之間表達無差異。結(jié)論三:NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后,經(jīng)PCR、RT-PCR、Western-blotting檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因和蛋白表達均較誘導(dǎo)前明顯增高。NPMSC和BMSC誘導(dǎo)后II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因和蛋白表達無明顯差異。NPMSC和BMSC在體外誘導(dǎo)條件下向軟骨細胞分化能力無明顯區(qū)別。結(jié)論:通過本次試驗證實了SD大鼠椎間盤髓核組織內(nèi)可以分離培養(yǎng)出具有干細胞特性的髓核干細胞,其次髓核干細胞和骨髓干細胞相比在體外誘導(dǎo)條件下成軟骨能力上相似,為組織工程提供了新的種子細胞。
【關(guān)鍵詞】：NPMSC(nucleus pulposus mesenchymal stem cells) BMSC(bone marrow mesenchymal stem cells) 增殖能力 多向分化能力
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.5
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 常用縮寫詞中英文對照表20-21
• 前言21-23
• 第一部分 NPMSC的分離培養(yǎng)鑒定23-41
• 1 材料與方法24-35
• 1.1 實驗動物24
• 1.2 主要試劑和儀器24-26
• 1.3 試驗方法26-35
• 2 結(jié)果35-39
• 2.1 NPMSC細胞形態(tài)觀察35
• 2.2 PCR檢測NPMSC干細胞基因表達35-36
• 2.3 PCR檢測NPMSC干細胞表面標記物36-37
• 2.4 NPMSC成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化37-39
• 3 討論39-41
• 第二部分 NPMSC和BMSC增殖能力和多向分化能力的比較41-64
• 1 材料與方法42-56
• 1.1 實驗動物42
• 1.2 主要試劑和儀器42-44
• 1.3 試驗方法44-56
• 2 結(jié)果56-62
• 2.1 NPMSC、BMSC細胞形態(tài)觀察56-57
• 2.2 NPMSC、BMSC細胞增殖能力的比較57
• 2.3 PCR檢測NPMSC、BMSC干細胞基因表達57-58
• 2.4 PCR檢測NPMSC、BMSC干細胞表面標記物58-59
• 2.5 NPMSC、BMSC成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化59-60
• 2.6 PCR檢測NPMSC、BMSC誘導(dǎo)后成骨、成脂、成軟骨基因的表達60-62
• 3 討論62-64
• 第三部分 NPMSC和BMSC成軟骨能力的比較64-85
• 1 材料和方法65-75
• 1.1 研究對象65
• 1.2 主要試劑和儀器65-67
• 1.3 實驗方法67-74
• 1.4 統(tǒng)計學方法74-75
• 2 結(jié)果75-81
• 2.1 NPMSC和BMSC在體外誘導(dǎo)條件下均可以向軟骨分化75
• 2.2 NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后PCR檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因表達均增高，兩者之間表達無差異75-77
• 2.3 NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后RT-PCR定量檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9基因表達均增高，兩者之間表達無差異77-78
• 2.4 NPMSC和BMSC成軟骨誘導(dǎo)后Western-blot定量檢測II型膠原、蛋白聚糖、SOX9蛋白表達均增高，兩者之間表達無差異78-81
• 3 討論81-84
• 4 結(jié)論84-85
• 參考文獻85-92
• 綜述92-110
• 參考文獻100-110
• 致謝110-111
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果111-112
• 個人簡歷112

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