發(fā)布時間：2017-05-13 05:05

  本文關鍵詞：VWF和ADAMTS13相互作用機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分血管性血友病因子裂解蛋白酶的真核穩(wěn)定表達及其活性檢測目的:本研究旨在得到重組的血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13),進一步研究其在血栓止血中的作用。方法:利用脂質體將編碼ADAMTS13全長序列的重組質粒p Sec Tag-ADAMTS13轉染Hela細胞,用潮霉素(hygromycin-B)篩選得到陽性克隆細胞株,并擴大培養(yǎng),收集上清。利用Ni-NTA瓊脂糖柱,梯度咪唑淋洗法純化蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鑒定純化產(chǎn)品純度和免疫學活性,采用GST-His雙抗夾心法測定蛋白剪切活性。結果:成功獲得一株能恒定分泌重組ADAMTS13蛋白的細胞株ADAMTS2-4,每1 L培養(yǎng)上清可純化到5.8 mg重組蛋白。Western blotting結果顯示,ADAMTS13多抗能與重組蛋白在190 k Da處顯單一條帶,并且蛋白具有6.4 U/m L的剪切活性(每m L正常人混合血漿中ADAMTS13活性為1U)。結論:重組蛋白具有較好的免疫原活性和酶活性,為進一步研究ADAMTS13作用機理和運用奠定了良好的基礎。第二部分2B/2M型VWD的A1區(qū)突變聯(lián)合血小板膜糖蛋白GPIbα影響ADAMTS13水解VWF的功能研究目的:血漿中,血管性血友病因子(VWF)多聚體分子大小由金屬蛋白酶ADAMTS13特異性調節(jié)。血小板膜糖蛋白(GP)Iα重組片段結合VWF的A1區(qū)后可以增強ADAMTS13水解VWF的能力。而2B型和2M型血管性血友病(VWD)分別是由于GPIα與VWF親和力增強或減弱而引起出血異常的。然而,2B/2M型VWD在A1區(qū)的突變與GPIα對ADAMTS13水解VWF的影響仍需作進一步的研究。方法:真核表達了不同類型的全長人重組VWF(r VWF),包括3個2B型突變(P1337L,H1268D,R1308C)、1個2M型突變(D1302G)和野生型(WT)。3種類型的r VWF經(jīng)多聚體分析、瑞斯托霉素誘導的血小板聚集(RIPA)和VWF輔因子實驗(VWF:RCo-ELISA)鑒定。經(jīng)鑒定后的r VWF在靜止或高剪切力條件(GPIα活性片段存在或不存在)被ADAMTS13水解。結果:靜止(非變性)或高剪切力條件,相較于野生型2B型突變體表現(xiàn)出對ADAMTS13更高的敏感性,而2M型突變體無明顯差別。在靜止(變性)或高剪切力(存在GPIα活性片段)條件下,野生型r VWF表現(xiàn)出甚至高過2個2B型突變體對ADAMTS13的敏感性。結論:位于A1區(qū)2B型突變通過對VWF自身構象的改變,能增強VWF對ADAMTS13結合從而提高敏感性。當GPIα參與時,野生型r VWF對ADAMTS13的敏感性急劇增加,而一些2B型突變卻增加不明顯。第三部分ADAMTS13單克隆抗體的鑒定以及生物學功能的研究目的:血漿金屬蛋白酶ADAMTS13通過水解VWF調節(jié)分子大小,是血小板的聚集和初期止血的關鍵分子蛋白。ADAMTS13-VWF軸的生理重要性主要體現(xiàn)在遺傳或獲得性ADAMTS13的缺失相關的血栓性血小板減少性紫癜(TTP)。制備鼠源性的抗人ADAMTS13的單抗對于研究ADAMTS13的功能至關重要。方法:利用真核表達的重組ADAMTS13截短型蛋白(ADAMTS13-T7)純品免疫Balb/c小鼠,經(jīng)標準單克隆抗體技術制備單抗。用ELISA方法鑒定單抗的特異性,利用免疫印跡技術確定單抗與全長ADAMTS13的識別能力。功能實驗方面,觀察單抗對ADAMTS13水解VWF的影響。結果:最終獲得6株抗ADAMTS13的單抗,克隆號分別為1G11、2F11、6G3、9E1、10A2、10B4。經(jīng)ELISA鑒定,純化后的單抗1G11和2F11的效價最高,另外與截短型ADAMTS13-T7蛋白結合能力明顯高于全長ADAMTS13蛋白。Western blotting結果顯示,6個單抗都能與全長ADAMTS13結合,1G11和2F11條帶最亮。另外,在功能實驗中,變性條件下,1G11和2F11能夠明顯抑制ADAMTS13水解VWF,并隨著單抗?jié)舛鹊脑黾佣种谱饔迷鰪姟＝Y論:進一步證實了ADAMTS13遠端區(qū)域確實可能靠近近端有折疊和接觸,從而減弱抗體與中心區(qū)域的結合。同時也為研究ADAMTS13作用機制提供有力的工具。
【關鍵詞】：血管性血友病因子裂解蛋白酶 真核表達 重組蛋白 血管性血友病因子裂解蛋白酶 血管性血友病因子 血小板GPIα 血管性血友病 血管性血友病因子裂解蛋白酶 血管性血友病因子 單克隆抗體
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R554.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 引言11-19
• 參考文獻16-19
• 第一部分 血管性血友病因子裂解蛋白酶的真核穩(wěn)定表達及其活性檢測19-28
• 材料和方法19-23
• 結果23-25
• 討論25-27
• 參考文獻27-28
• 第二部分 2B/2M型VWD的A1 區(qū)突變聯(lián)合血小板膜糖蛋白GPIbα 影響ADAMTS13水解VWF的功能研究28-54
• 材料和方法29-38
• 結果38-48
• 討論48-50
• 參考文獻50-54
• 第三部分 ADAMTS13 單克隆抗體的鑒定以及生物學功能的研究54-71
• 材料和方法55-62
• 結果62-67
• 討論67-68
• 參考文獻68-71
• 全文總結71-72
• 綜述72-93
• 參考文獻83-93
• 攻讀博士學位期間發(fā)表論文及參與課題93-95
• 致謝95-96

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本文編號：361611