發(fā)布時間：2022-01-27 01:58

　　近年來單克隆抗體藥物發(fā)展迅速,已成為全球新藥開發(fā)的熱點。單抗在臨床上主要用于腫瘤、自身免疫性疾病及炎癥疾病的治療。單抗的分子量、體積和極性都遠(yuǎn)大于小分子,使得單抗與小分子藥物在藥代動力學(xué)特征上具有非常大的差異。腸外給藥、分布容積小、消除半衰期長是單抗最顯著的臨床藥代動力學(xué)特征。一直以來,蛋白類藥物生物分析的首選方法是配體結(jié)合分析（LBA）,但由于LBA的局限性,近年有研究者提出了LC-MS/MS的補充/替代分析策略。本課題分別建立了LC-MS/MS法對血清中的兩種單抗（SHR-1603和SHR-1222）進行定量檢測,經(jīng)驗證的LC-MS/MS方法都分別應(yīng)用于兩種藥物的臨床前研究,并與兩種單抗藥物的電化學(xué)發(fā)光法（MSD-ECL,基于LBA的分析方法）進行比較。1.電化學(xué)發(fā)光法測定食蟹猴和大鼠血清中SHR-1603SHR-1603是由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)的全人源化單抗,作用靶點為CD47,目前處于臨床I期,臨床擬用于腫瘤治療。首先建立了MSD-ECL法分別檢測食蟹猴和大鼠血清中的SHR-1603。該方法的定量范圍為19.5¹0000ng/mL,允許血清樣品進行... 

【文章來源】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海藥物研究所)上海市

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

抗體的結(jié)構(gòu)與分類Figure1-1Structureandclassificationofantibodies

LC-MS/MS法檢測血清中的單克隆抗體SHR-1603和SHR-122212前試驗中也觀察到了類似的效果[138]。圖1-2抗CD47抗體阻斷“別吃我”通路，引發(fā)吞噬作用（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）Figure1-2TheroleofCD47incancerandthemechanismofanti-CD47monoclonalantibodiesincancertreatment.本研究中的藥物SHR-1603是由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)，靶向CD47的抗體藥物，具有IgG4結(jié)構(gòu)，目前處于臨床I期的研究階段，擬用于腫瘤治療。目前還未有關(guān)于SHR-1603生物分析的文獻報告。本研究將采用食蟹猴和SD大鼠考察SHR-1603注射液的藥代動力學(xué)，揭示其在食蟹猴和SD大鼠體內(nèi)的處置規(guī)律，為SHR-1603注射液后續(xù)的臨床試驗方案設(shè)計提供試驗依據(jù)。1.4.2硬骨素與SHR-1222骨質(zhì)疏松（osteoporosis）是由多種原因引起的一種以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點的骨代謝性疾病，以骨丟失、微結(jié)構(gòu)惡化和骨強度受損為特征，常表現(xiàn)為骨骼疼痛、易于骨折等[139,140]，常發(fā)于絕經(jīng)后婦女中[141-143]。在脆性骨折中，脊椎和髖部骨折的發(fā)病率和死亡率最高[144,145]。隨著人口老齡化，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，由此所帶來的社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)大幅增加，須引起人們的警惕[146]。骨重建是骨形成和骨吸收相互作用的動態(tài)過程，為了維持骨的動態(tài)平衡，骨形成和骨吸收必須保持動態(tài)平衡。在這個過程中，成骨細(xì)胞的作用是引導(dǎo)骨形成，而破骨細(xì)胞則引導(dǎo)骨吸收[147]。治療骨質(zhì)疏松的傳統(tǒng)方式主要有：服用抑制骨吸收的藥物，如鈣劑、維生素D及活性維生素D、降鈣素、二磷酸鹽（阿侖膦酸鈉）、雌激素以及異黃酮；促進骨形成的藥物，如氟化物、合成類固醇、甲狀旁腺激素以及異黃酮。但是傳統(tǒng)藥物只能應(yīng)癥，不能使患者的骨重建過程恢復(fù)平衡。

第3章兩種LC-MS/MS法測定食蟹猴和大鼠血清中的SHR-160329圖3-1兩種LC-MS/MS法和MSD-ECL法的實驗流程Figure3-1workflowoftwoLC-MS/MSmethodsandMSD-ECLmethodStraightLC-MS/MS法2.00μL血清樣品加到96聚丙烯孔板中，加入9倍體積含0.1%SDS的PBS溶液，充分混合，將樣品稀釋10倍（實際操作中，為避免操作誤差，可以按比例放大體積進行10倍稀釋，但只取20.0μL加入聚丙烯96孔板中）。加入20.0μLDTT（100mmol/L），放入恒溫振蕩器中60°C、300rpm下反應(yīng)30min。冷卻至常溫后加入20μL的IAA（250mmol/L），在避光條件下室溫反應(yīng)15min。然后在混合物中加入180μL的冰甲醇進行蛋白沉淀，1000rpm震蕩10min，4°C離心10min。小心地除去上清液，將蛋白沉淀留在孔板底部。向孔板中的蛋白沉淀（pellet）相繼加入80μL碳酸氫銨緩沖液（50mmol/L，pH=8.0），內(nèi)標(biāo)溶液20μL（250ng/mL），10μL胰蛋白酶（100ug/mL）和10μLBSAdigest（20×）。將此混合物體系放入恒溫震蕩器，在60°C、1400rpm的條件下孵育1.5小時。將孔板拿出冷卻至室溫，加入30μL終止液（含1%TFA的60%ACN），常溫下1000rpm震蕩10min以終止酶切。該體系充分混勻之后，放入自動進樣器等待進行檢測，進樣量10.0μL。IA-LC-MS/MS法與straightLC-MS/MS法不同的是，該法對樣品進行了預(yù)先純化富集。具體實驗步驟如下：


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