Stk40（Serine/threonine kinase 40）是一個含有絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的假激酶。此前,本課題組在研究小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells,mESCs）多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4的下游靶基因時,發(fā)現(xiàn)Stk40受到Oct4的直接調(diào)控。Stk40上調(diào)會激活Erk/MAPK信號通路,誘導(dǎo)mESC向胚外內(nèi)胚層分化。對Stk40基因敲除(Stk40 knock out,Stk40^-/-)小鼠的研究表明,Stk40^-/-小鼠出現(xiàn)肺部發(fā)育障礙,導(dǎo)致出生后很快死亡。對Stk40生理功能的研究表明,Stk40抑制小鼠脂肪細(xì)胞的分化,促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的成熟。同時紅細(xì)胞的成熟過程也需要Stk40的參與�？紤]到上述脂肪、肌肉和造血細(xì)胞都來源于中胚層,基于Stk40的這些功能,我們推測Stk40可能在中胚層分化中發(fā)揮重要作用。本研究通過體內(nèi)和體外分化實(shí)驗(yàn)證明,Stk40缺失導(dǎo)致中胚層細(xì)胞分化受阻。在mESC向中胚層細(xì)胞分化的過程中,敲除Stk40導(dǎo)致表達(dá)中胚層標(biāo)志基因T（Brachyury）的細(xì)胞數(shù)量減少,中胚層相... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

STK40蛋白保守序列示意圖[4]

博士學(xué)位論文Stk40調(diào)控中胚層發(fā)育的功能和機(jī)制的研究胡靜8異都可能使Stk40失去結(jié)合ATP和2價金屬離子的能力。雖然一些假激酶在DFG結(jié)構(gòu)域突變后，在特定條件下仍然能發(fā)揮激酶的功能[5]，但是目前的研究發(fā)現(xiàn)STK40的激酶結(jié)構(gòu)域缺乏與ATP結(jié)合的能力，而且在體外激酶反應(yīng)中STK40沒有自我磷酸化的能力[6]。圖2.STK40蛋白序列與經(jīng)典激酶序列比對示意圖[4]Figure2.Multiplesequencealignmentofcanonicalkinasemotifs我們的體外激酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在293FT細(xì)胞中過表達(dá)純化的Stk40蛋白，western-blot結(jié)果顯示其特異的磷酸化修飾條帶，這說明Stk40能被磷酸化修飾。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也說明Stk40可能在第6位和第250位絲氨酸上有磷酸化修飾。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然Stk40是缺乏激酶活性的假激酶，但是它本身可能被其它激酶磷酸化修飾。1.1.2Stk40的功能在我們實(shí)驗(yàn)室此前的研究中，通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)Stk40為Oct4的下游靶基因[7]。Oct4結(jié)合Stk40的基因調(diào)控序列并抑制其轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Stk40通過與Rcn2相互作用激活MAPK信號通路，促進(jìn)mESCs向胚外內(nèi)胚層分化（圖3）。

博士學(xué)位論文Stk40調(diào)控中胚層發(fā)育的功能和機(jī)制的研究胡靜9圖3.Stk40在胚外內(nèi)胚層分化過程中的功能[7]Figure3.AmodelforthefunctionofStk40inextraembryonicdifferentiation在小鼠胚胎發(fā)育第18.5天檢測各個器官和組織中Stk40的蛋白表達(dá)水平，可以發(fā)現(xiàn)Stk40廣泛表達(dá)，說明Stk40可能參與了多個器官組織的正常發(fā)育（圖4）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Stk40的功能，Yu等構(gòu)建了Stk40基因敲除的小鼠，策略如下：用大腸桿菌半乳糖苷酶（LacZ）和抗性基因Neomyocin序列同源重組替換基因組上Stk40的第二和第三個外顯子基因序列（圖5）。圖4.Stk40蛋白在胚胎發(fā)育18.5天時各組織器官中的表達(dá)情況[8]Figure4.ProteinlevelsofStk40indifferenttissuesandorgansisolatedfrommouseembryosatE18.5圖5.Stk40基因敲除策略[9]


本文編號：3597200