本文關(guān)鍵詞：REG3A促進(jìn)AD-HIES支氣管上皮細(xì)胞增殖修復(fù)的作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分AD-HIES息兒肺部金葡菌感染后炎癥反應(yīng)、肺組織破壞程度和REG3A的表達(dá)目的： 闡明常染色體顯性遺傳高IgE綜合征(AD-HIES)患兒肺部金葡菌感染后炎癥反應(yīng)和肺組織破壞性損傷程度；探索AD-HIES患兒肺部反復(fù)金葡菌感染致肺組織破壞損傷的分子機(jī)理；明確AD-HIS患兒STAT3基因突變對肺組織局部IL-17、IL-22和REG3A表達(dá)水平的影響。方法：對10例AD-HIES患兒肺炎情況、肺部感染的病原菌和肺部合并癥相關(guān)臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計分析。肺組織病理切片進(jìn)行HE染色觀察肺組織結(jié)構(gòu)改變。Bio-plex懸液芯片系統(tǒng)檢測AD-HIES患兒血漿Th17相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)水平。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測AD-HIES患兒外周血Th17細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞數(shù)量。免疫組化檢測肺組織p-STAT3、IL-17、IL-22和REG3A表達(dá)水平。結(jié)果： 10例AD-HIES患兒均有反復(fù)肺炎,7例有典型的金黃色葡萄球菌肺炎,其中5例伴有“肺大泡”,2例接受肺葉切除手術(shù)。肺組織HE染色結(jié)果顯示AD-HIES患兒肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,感染灶內(nèi)中性粒細(xì)胞較少,嗜酸性粒細(xì)胞大量聚集。Bio-plex懸液芯片系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)AD-HIES患兒與健康對照兒童比較,血漿IL-17濃度降低(P0.05),IL-6濃度升高(P0.001),IL-22濃度無明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)AD-HIES患兒與健康對照兒童比較,外周血Th17(P0.001)和IL-17+γβT細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P0.01)。肺組織免疫組化檢測結(jié)果顯示AD-HIES患兒肺組織p-STAT3、IL-17、IL-22和REG3A表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論：AD-HIES患兒自幼易患肺炎,以金葡菌肺炎為主。金葡菌肺部感染致肺組織破壞損傷嚴(yán)重,提示AD-HIES患兒肺組織修復(fù)功能可能存在缺陷。STAT3基因突變導(dǎo)致Th17和IL-17+γδT細(xì)胞數(shù)量減少,IL-17表達(dá)水平下降,以及肺組織IL-22、p-STAT3和REG3A表達(dá)降低可能是AD-HIES患兒反復(fù)肺部金葡菌感染和肺組織修復(fù)功能缺陷的主要原因。第二部分AD-HIES相關(guān)STAT3基因突變抑制支氣管上皮16HBE細(xì)胞REG3A表達(dá)目的： 闡明AD-HIES相關(guān)STAT3基因三種突變R382W、V637M和T620S對支氣管上皮16HBE細(xì)胞REG3A表達(dá)的影響。探索促進(jìn)REG3A表達(dá)的調(diào)節(jié)因素及其機(jī)制。方法：STAT3野生型質(zhì)粒(STAT3-Wt)和三種STAT3突變質(zhì)粒(STAT3-R382W、STAT3-V637M和STAT3-T620S)分別轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞后,Western blot驗證STAT3質(zhì)粒在16HBE細(xì)胞中的表達(dá)。金葡菌感染16HBE細(xì)胞后,Real-time PCR檢測REG3A、IL-6、IL-17和IL-22的差異表達(dá)。利用不同濃度的IL-6、IL-17或IL-22處理16HBE細(xì)胞,Real-time PCR和Western blot檢測分析16HBE細(xì)胞中REG3A表達(dá)水平的變化。最后,給予金葡菌感染或最佳作用濃度的IL-17和L-22處理轉(zhuǎn)染STAT3突變質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞,Western blot檢測REG3A和p-STAT3表達(dá)水平,比較STAT3基因不同位點的突變對REG3A表達(dá)的影響。結(jié)果：金葡菌感染16HBE細(xì)胞后,Real-time PCR檢測結(jié)果顯示REG3A和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高,而IL-17和IL-22無表達(dá)；Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)金葡菌明顯上調(diào)16HBE細(xì)胞REG3A、 STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平。金葡菌感染STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞,Western blot檢測結(jié)果顯示,R382W、V637M和T620S均明顯抑制REG3A表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)STAT3基因突變影響STAT3磷酸化,從而顯性負(fù)性調(diào)控REG3A表達(dá)。利用不同濃度的IL-6、IL-17或IL-22處理16HBE細(xì)胞,Real-time PCR檢測結(jié)果顯示250 ng/ml IL-6、50 ng/ml IL-17或400 ng/ml IL-22可顯著上調(diào)REG3A表達(dá)水平。給予最佳作用濃度的IL-17和L-22處理轉(zhuǎn)染STAT3突變質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞,Western blot檢測結(jié)果顯示,R382W、V637M和T620S均明顯抑制STAT3磷酸化。結(jié)論：金葡菌和一定濃度的IL-6、IL-17和IL-22細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞STAT3磷酸化,上調(diào)REG3A的表達(dá)水平。AD-HIES相關(guān)STAT3基因突變(R382W、V637M和T620S)顯性負(fù)性調(diào)控16HBE細(xì)胞內(nèi)源性STAT3磷酸化,從而抑制REG3A表達(dá)。第三部分REG3A通過PI3K/AKT信號通路促進(jìn)AD-HIES STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞增殖目的：闡明REG3A對STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。探索PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平在REG3A促進(jìn)16HBE細(xì)胞增殖中的變化。明確REG3A促進(jìn)STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞增殖的信號通路。方法：重組REG3A、IL-17和IL-22分別處理轉(zhuǎn)染STAT3突變基因的16HBE細(xì)胞,Cell Counting Kit-8實驗方法檢測不同STAT3基因突變類型的16HBE細(xì)胞增殖情況。利用PI3K抑制劑(Wortmannin)和重組REG3A聯(lián)合或分別處理16HBE細(xì)胞,Cell Counting Kit-8實驗方法檢測16HBE細(xì)胞增殖情況。Western blot檢測重組REG3A處理轉(zhuǎn)染STAT3突變基因的16HBE細(xì)胞后,REG3A受體EXTL3和PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果：重組REG3A、IL-17和IL-22分別處理轉(zhuǎn)染STAT3突變基因的16HBE細(xì)胞,Cell Counting Kit-8檢測結(jié)果顯示重組REG3A能夠促進(jìn)STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞增殖,表明REG3A促進(jìn)16HBE細(xì)胞增殖并不依賴STAT3信號通路；而IL-17和IL-22對STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞增殖無影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),與重組REG3A單獨處理組比較,重組REG3A和PI3K抑制劑聯(lián)合處理16HBE細(xì)胞后,細(xì)胞增殖能力降低,說明REG3A通過P13K信號通路促進(jìn)16HBE細(xì)胞增殖。Western blot檢測結(jié)果顯示,重組REG3A上調(diào)其受體EXTL3的表達(dá)；重組REG3A處理轉(zhuǎn)染STAT3突變基因的16HBE細(xì)胞后,p-AKT蛋白表達(dá)水平升高；而IL-17和IL-22對STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞p-AKT蛋白表達(dá)無影響。結(jié)論：REG3A作用于EXTL3受體,激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)AD-HIES相關(guān)STAT3基因突變(R382W、V637M和T620S)的16HBE細(xì)胞增殖；而IL-17和IL-22對STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞增殖無影響,說明REG3A可通過STAT3非依賴途徑促使支氣管上皮細(xì)胞增殖和修復(fù),對AD-HIES患者的肺部損傷可能有治療作用。
【關(guān)鍵詞】：常染色體顯性遺傳高IgE綜合征 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 金黃色葡萄球菌 胰島再生源蛋白3A IL-17 胰島再生源蛋白3A STAT3 金黃色葡萄球菌 IL-17 IL-22 增殖 16HBE細(xì)胞 STAT3 EXTL3 PI3K
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.9
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-19
• 前言19-26
• 參考文獻(xiàn)23-26
• 第一部分 AD-HIES患兒肺部金葡菌感染后炎癥反應(yīng)、肺組織破壞程度和REG3A的表達(dá)26-51
• 前言26-27
• 1 材料與方法27-35
• 2 結(jié)果35-44
• 3 討論44-47
• 4 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 第二部分 AD-HIES相關(guān)STAT3基因突變抑制支氣管上皮16HBE細(xì)胞REG3A表達(dá)51-86
• 前言51
• 1 材料與方法51-66
• 2 結(jié)果66-80
• 3 討論80-83
• 4 小結(jié)83-84
• 參考文獻(xiàn)84-86
• 第三部分 REG3A通過PI3K/AKT信號通路促進(jìn)AD-HIES STAT3基因突變的16HBE細(xì)胞增殖86-104
• 前言86
• 1 材料與方法86-88
• 2 結(jié)果88-99
• 3 討論99-101
• 4 小結(jié)101-102
• 參考文獻(xiàn)102-104
• 全文總結(jié)104-106
• 課題創(chuàng)新性106
• 課題不足之處及展望106-107
• 文獻(xiàn)綜述107-120
• 參考文獻(xiàn)113-120
• 致謝120-121
• 攻讀博士學(xué)位期間研究成果及發(fā)表論文121

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本文編號：355347