從全世界發(fā)病率來看,乳腺癌已經(jīng)成為危害女性健康最常見的惡性腫瘤之一。依據(jù)世界癌癥統(tǒng)計學預計,在2012年中估計有170萬的新病例被確診為乳腺癌,占女性全部癌癥病例的25%,其中有521,900的患者死亡,占女性癌癥死亡總數(shù)的15%。目前,乳腺癌雖然通過手術、放化療、內(nèi)分泌治療以及靶向治療等綜合治療大大提高了乳腺癌患者的生存率,但是最終還是會引起癌細胞的轉(zhuǎn)移。根據(jù)研究表明,乳腺癌在治療后的第一個3年,大約有10–15%的患者會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。因此探究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機制已成燃眉之急。Circular RNA（CircRNAs）,一種新穎的、長的、內(nèi)源性非編碼RNA分子,介導轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控。CircRNAs普遍存在于各類真核細胞的細胞質(zhì)中,其結構相對穩(wěn)定且序列高度保守。最近研究發(fā)現(xiàn),circRNAs大量富集miRNAs結合位點,可以通過競爭性海綿、結合miRNAs,抑制miRNAs的活性,從而解除其對靶基因的調(diào)控,進而介導細胞的生物學功能。目前,circRNA已經(jīng)成為研究中的熱點,但是circRNA在乳腺腫瘤中的侵襲調(diào)控機制尚不清楚,因此本實驗主要研究circRNA與乳腺癌之間的關... 

【文章來源】：東南大學江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

環(huán)狀RNA的來源與功能

Foxo3基因可以編碼circular Foxo3和線性RNA Foxo3[57]。先前的研究證實,Foxo3是一種抑癌基因,并與腫瘤的進展相關[58]。此外,Foxo 3還可通過介導AKT、PTEN、細胞周期蛋白和細胞周期依賴性激酶(CDKs)來調(diào)節(jié)細胞功能[59,60]。Foxo3的轉(zhuǎn)錄本由7341個核苷酸組成,而環(huán)狀RNA Foxo 3僅由1435個核苷酸組成。而且,環(huán)狀RNA Foxo3、Foxo3P和Foxo3之間有25個相同的結合位點。這意味著這些序列可能在生物學上起著至關重要的作用[61]。通過進一步的實驗發(fā)現(xiàn)circ-Foxo 3在非癌細胞中高表達,并與細胞增殖和細胞周期有關。Circ-Foxo3的異位表達抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,阻滯細胞周期在G1期。此外,我們還發(fā)現(xiàn)circ-Foxo3與細胞周期蛋白、細胞周期依賴性蛋白激酶2(CDK 2)和周期獨立激酶抑制劑1或p21結合,抑制細胞周期的進展。細胞周期依賴性激酶(CDK)是細胞周期進展的調(diào)節(jié)因子,CDK2是G1-S相變中必不可少的調(diào)節(jié)因子。P21Cip1/Waf1和p27Kip1是兩種非常重要的細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑,它們負調(diào)控GO-G1期進程[62]。Circ-Foxo3作用于p21和CDK2,形成circ-Foxo3-p21-CDK 2三元配合物,抑制CDK2與cycline的結合,從而阻礙細胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變[63]。同時還發(fā)現(xiàn),circ-Foxo3能誘導細胞凋亡。眾所周知,p53是誘導細胞周期阻滯的一種中介物,它有助于DNA的修復或DNA的損傷,從而導致細胞凋亡[64]。Circ-Foxo3促進MDM2與p53的結合,導致MDM2誘導p53泛素化和降解,從而抑制p53的表達。同樣,circ-Foxo3可以減少MDM2誘導的Foxo3泛素化和降解,從而增加Foxo3的表達,進而促進了Puma基因的表達而觸發(fā)細胞凋亡[65,66]。(圖2)環(huán)狀RNA與胃癌

為研究circRNA與乳腺癌遷移侵襲的關系,通過Agilent human circRNA Array V2.0芯片技術,我們對乳腺癌的高侵襲性細胞(MDA-MB-231)和低侵襲性細胞(MCF-7)進行circRNA表達譜的初篩,發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中分別含有49260和50306個circRNAs,然后用Lowess法進行歸一化,再用SAM(Significance Analysis of Microarrays)軟件對差異基因進行分析,微陣列芯片共鑒定出29788個差異表達的circRNAs(偽發(fā)現(xiàn)率FDR<0.05,倍數(shù)差異FC≥2),其中14721個circRNAs上調(diào),15067個circRNAs下調(diào)(圖1-1A)。為進一步降低circRNAs因在某一細胞中含量較低而造成差異倍數(shù)的幾率,在上述基礎上再次進行以下設置:(1)對于在MDA-MB-231細胞中上調(diào)的circRNAs而言,它們在MDA-MB-231細胞中的表達水平一定高于MDA-MB-231細胞中circRNAs的中位表達水平。同樣的,對于在MDA-MB-231細胞中下調(diào)的circRNAs,其在MCF-7細胞中的表達水平一定高于MCF-7細胞中circRNAs的中位表達水平。(2)對倍數(shù)差異設置為4倍或4倍以上。結果發(fā)現(xiàn)共有5842個差異性表達circRNAs,其中2598個circRNAs上調(diào),3244個circRNAs下調(diào)(圖1-1B)。然后我們進一步對倍數(shù)差異為4倍或4倍以上的circRNAs的長度分布進行分析,發(fā)現(xiàn)其長度分布只要集中在800nt以下(圖1-1C)。隨后為證實circRNA芯片表達譜結果的可靠性,我們選擇在MDA-MB-231細胞中上調(diào)的circRNAs進行驗證,同時把circRNAs的長度縮小到500nt以下,并把差異倍數(shù)升高到了10倍。如圖1-1D,通過實時定量PCR驗證,發(fā)現(xiàn)與MCF-7細胞相比,hsa_circ_0052112在MDA-MB-231細胞中表達顯著上調(diào)(18.84±0.81倍)(p<0.01),與芯片結果一致。圖1-1微陣列芯片檢測乳腺癌細胞株中circ RNA的表達水平


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