外泌體（exosomes）是幾乎所有細(xì)胞都分泌的一種脂質(zhì)納米囊泡,存在于各種體液中。通過特定的形成機(jī)理,外泌體攜帶供體細(xì)胞中的成分釋放到胞外,被認(rèn)為是細(xì)胞排放垃圾和與外界交流的一種重要方式。研究表明,外泌體可以根據(jù)自己所攜帶的成分跟附近或遠(yuǎn)端的細(xì)胞發(fā)生作用,并使其在受體細(xì)胞中發(fā)揮不同的功能。而外泌體的不同功能主要是基于供體細(xì)胞根據(jù)自身狀態(tài)調(diào)節(jié)所分泌外泌體成分和數(shù)量來實(shí)現(xiàn)。因此,作為細(xì)胞自身釋放的一種天然納米囊泡,由于其成分不僅能反應(yīng)細(xì)胞自身狀態(tài),還能在體內(nèi)運(yùn)輸功能活性分子,外泌體具有作為一種天然納米藥物運(yùn)送載體及腫瘤診療標(biāo)志物的潛力。雖然,外泌體作為腫瘤診療標(biāo)志物及藥物運(yùn)送載體具有巨大潛力和優(yōu)點(diǎn),但其相關(guān)研究還不成熟。為此,探索外泌體在腫瘤診療中的作用是現(xiàn)在研究的重點(diǎn)。本文基于外泌體作為腫瘤診斷標(biāo)志物及藥物遞送載體的潛力和優(yōu)點(diǎn),對外泌體在白血病診療中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。研究工作主要分為以下幾個部分:首先,通過對白血病細(xì)胞系來源外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),核仁素具有作為識別白血病相關(guān)外泌體標(biāo)志物之一的潛力。其次,基于對外泌體上核仁素蛋白的識別,設(shè)計了一個檢測白血病相關(guān)外泌體的雙信號放大熒光... 

【文章來源】：東南大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

外泌體的生物起源分子機(jī)制[8]

通過慢病毒包裝和浸染的方法,融合蛋白(Palm-EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP)和RNA(BFP-miR-21sponge-MS2)的基因序列可以被整合到293T細(xì)胞的基因組上,使其穩(wěn)定表達(dá)蛋白和RNA。因此,我們通過病毒的包裝方法首先收集了分別包裝上述三種基因的慢病毒,圖5-2a是293T細(xì)胞包裝病毒后的熒光成像圖。其中,轉(zhuǎn)染上述三種質(zhì)粒后的細(xì)胞都表達(dá)了相應(yīng)的熒光蛋白,說明三個表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入到了細(xì)胞。隨后,把收集的三種病毒同時對293T細(xì)胞進(jìn)行侵染,如果病毒成功的把三個基因都整合到了細(xì)胞的基因組,293T細(xì)胞就會同時表達(dá)EGFP、mCherry和BFP三種熒光蛋白。通過流式細(xì)胞儀的熒光篩選,即可得到所需的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(工程化293T細(xì)胞)。然后,將分選得到的細(xì)胞放到含有10%FBS和雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后用酶標(biāo)儀對其進(jìn)行成像驗證。如圖5-2b所示,通過流式分選的細(xì)胞全部都有上述三種熒光的表達(dá),表明我們成功篩選得到了所需的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。5.4.2 藍(lán)光調(diào)控RNA在細(xì)胞膜上富集的驗證

為了觀察上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白和RNA能否發(fā)揮功能,我們采用激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞中的蛋白和RNA進(jìn)行了成像分析。如圖5-3a所示,其是激光共聚焦顯微鏡對工程化293T細(xì)胞中Palm-EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP位置變化的分析結(jié)果。從圖中可以看到,mCherry的紅色熒光在488 nm藍(lán)光刺激前是均勻分布在整個細(xì)胞質(zhì)中的,EGFP表達(dá)的綠色熒光富集到了整個細(xì)胞質(zhì)膜上。但488 nm藍(lán)光刺激后,mCherry的紅色熒光快速遷移到了細(xì)胞質(zhì)膜上(大概不到1s),并與EGFP的綠色熒光重疊。此外,在488 nm的藍(lán)光刺激20 min后,mCherry的紅色熒光又由于CIBN和CYR2的可逆相互作用重新分布在了整個細(xì)胞質(zhì)中。圖5-3b是對細(xì)胞中RNA能否隨著CRY2-mCherry-MCP蛋白富集到細(xì)胞質(zhì)膜上的驗證。為此,我們把Palm-CIBN、CRY2-mCherry-MCP和FAM-MS2共同轉(zhuǎn)染到了293T細(xì)胞中。隨后,通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像分析。結(jié)果表明,在488 nm藍(lán)光刺激前的FAM和m Cherry會均勻的分布在整個細(xì)胞質(zhì)中。但488 nm藍(lán)光持續(xù)刺激細(xì)胞后,大量的綠色和紅色熒光便迅速轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞質(zhì)膜上。此外,為了證明上述結(jié)果的可靠性,我們還采用了沒有Palm序列的EGFP-CIBN蛋白作為對照。如圖5-4a所示,在沒有Palm序列的時候,EGFP的綠色和m Cherry的紅色熒光在488 nm藍(lán)光激發(fā)前后都會隨機(jī)分布在細(xì)胞質(zhì)中,而不會遷移到質(zhì)膜上。同時,在沒有Palm序列時,轉(zhuǎn)染的FAM-MS2適配體也不會通過488 nm藍(lán)光刺激遷移到細(xì)胞質(zhì)膜上(圖5-4b、圖5-4c)。因此,這些結(jié)果可以表明藍(lán)光介導(dǎo)的CIBN-CYR2作用和MS2-MCP作用可以使細(xì)胞中的RNA富集到細(xì)胞質(zhì)膜上。圖5-4藍(lán)光對細(xì)胞中蛋白定位的影響。(a)293T細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP后的激光共聚焦顯微鏡成像;(b)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAM-MS2后的激光共聚焦顯微鏡成像;(c)細(xì)胞轉(zhuǎn)染CINB、CRY2-m Cherry-MCP和FAM-MS2后的激光共聚焦顯微鏡成像。在所有成像中,FAM和m Cherry都需在4 8 8 nm藍(lán)光刺激前后分別成像。標(biāo)尺:10μm


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