炎癥小體是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在抵抗病原入侵和維持機體穩(wěn)態(tài)等方面都發(fā)揮了不可或缺的作用。炎癥小體主要是天然免疫細胞內(nèi)的多蛋白復合體,由位于細胞質的模式識別受體、接頭蛋白ASC和天冬氨酸蛋白水解酶caspase-1組成。在受到特定刺激后,受體蛋白、ASC和caspase-1聚集并引起caspase-1互相切割而獲得活性,進而切割其下游底物gasdermin D（GSDMD）、白細胞介素（Interleukin,IL）-1β和IL-18。被切割的GSDMD會導致細胞焦亡以及成熟的IL-1β和IL-18分泌。然而,除了IL-1β和IL-18之外,還有很多細胞內(nèi)蛋白會在炎癥小體激活之后通過非經(jīng)典途徑分泌。另外,隨著研究的深入,人們也逐漸意識到炎癥小體的很多功能并不能只通過熟知的IL-1β和IL-18這兩個效應分子來解釋。那么其它的效應分子是什么,它們有什么樣的功能卻不為所知。因此,我的博士論文工作以此為出發(fā)點,通過質譜分析小鼠巨噬細胞的蛋白質分泌組,鑒定到一組蛋白,其中以galectin-3為代表。我們發(fā)現(xiàn)它在炎癥小體激活后會大量地分泌。Galectin-3的分泌對炎癥小體的特異性沒有... 

【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院上海巴斯德研究所)上海市

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

LS-MS/MS鑒定分析炎癥小體依賴的巨噬細胞蛋白質分泌組

第3章實驗結果23件下（LPS+ATP）的分泌組。利用非標記的定量液相二級質譜分析，一共鑒定到733個蛋白，其中129個蛋白僅出現(xiàn)在WT的分泌組中，另有3個蛋白只出現(xiàn)在Nlrp3-/-的分泌組中。在兩組中都出現(xiàn)的604個蛋白中，有78個蛋白在WT組中的豐度顯著高于Nlrp3-/-組（WT/Nlrp3-/-≥2,P＜0.05）。此外，有6個蛋白在WT組中的豐度則顯著低于Nlrp3-/-組（WT/Nlrp3-/-≤2,P＜0.05）（圖3.1A）。通過基因功能注解（GeneOntology,GO）的細胞組分（CellularComponent,CC）分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白都位于細胞內(nèi)部（圖3.1B），因而不同于通過經(jīng)典分泌途徑內(nèi)質網(wǎng)-高爾基體組成性分泌的蛋白。3.1.22D-PAGE-MS分析炎癥小體依賴的巨噬細胞分泌組由于不同的刺激會改變細胞的響應方式，因而也會影響細胞蛋白的分泌。另外，ATP單獨刺激也會引起蛋白質的分泌。而且非標記LC-MS/MS僅能區(qū)別不同組之間蛋白質豐度的差異，卻不能反映它們的絕對豐度，因此，我們利用2D-PAGE比較了只由LPS刺激的WT和Nlrp3+/R258W（NLRP3功能獲得性突變，可由LPS激活）BMDM的分泌蛋白（圖3.2A）。圖3.22D-PAGE與MS偶聯(lián)分析炎癥小體依賴的巨噬細胞分泌蛋白圖注：（A），2D-PAGE分析LPS刺激的WT和Nlrp3+/R258WBMDM的細胞培養(yǎng)上清，將圖中數(shù)字標注的蛋白質斑點取出做質譜分析。（B），從（A）中取出的蛋白質斑點經(jīng)質譜鑒定得到的蛋白質信息。因為LPS刺激可以激活Nlrp3+/R258WBMDM中的NLRP3炎癥小體，卻不能激活WTBMDM中的NLRP3炎癥小體93，我們在2D-PAGE中發(fā)現(xiàn)了許多差異明顯的蛋白斑點，將其中差異明顯的蛋白斑點（圖3.2A中由數(shù)字標記）取出做質譜鑒定，得到了如圖2B所示的9個蛋白（圖3.2B）。與非標記LC-MS/MS的

第3章實驗結果24結果整合分析后，發(fā)現(xiàn)4個蛋白（圖3.2B紅色標記）在WT和Nlrp3+/R258W組間差別顯著。3.2炎癥小體調(diào)控Galectin-3的分泌3.2.1Galectin-3是潛在的炎癥小體效應分子通過比較4個蛋白在WT和Nlrp3-/-組間的差別，galectin-3和PPIA的差異明顯（分別為6.25倍和9.1倍），且顯著（分別為P＜0.02和P＜0.01）(圖3.3A-B)。根據(jù)文獻報道，galectin-3和PPIA都能夠分泌到細胞外，并且在不同的生理和病理條件下發(fā)揮著重要的作用。PPIA是免疫親和蛋白家族的成員，廣泛分布于各種細胞中97。能通過肽酰-脯氨酰順反異構酶活性催化蛋白質順反異構化，調(diào)節(jié)蛋白質折疊和運輸97。胞外的PPIA也有多種功能，包括傳遞促炎信號、招募免疫細胞等，而目前報道的PPIA的主要作用在影響血管功能及參與如動脈粥樣硬化等血管疾病的進展97。圖3.3Galectin-3是潛在的炎癥小體效應分子圖注：（A），列表中的蛋白質在LC-MS/MS中的數(shù)據(jù)分析。（B），LC-MS/MS的火山圖分析。Galectin-3屬于凝集素家族。與其他半乳糖凝集素不同，galectin-3由氨基端的非凝集素結構域和羧基端的糖類識別結構域（carbohydraterecognitiondomain,CRD）組成98。Galectin-3主要通過它羧基端的CRD特異地識別β-galactosides99，而它的氨基端則有助于galectin-3形成同源多聚體�，F(xiàn)有的文獻報道顯示，胞外的galectin-3參與免疫調(diào)節(jié)、腫瘤的進展、代謝、細胞-細胞以及細胞-基質間的粘附、軟骨和骨基質重塑、器官纖維化、動脈粥樣硬化和其它血管疾病98,100,101。同時血清中的galectin-3也逐漸成為一個新的疾病診斷和預后的標志物102。由于MartinKeller等人在UVB處理的人角質細胞分泌組中發(fā)現(xiàn)了galectin-3，可是它的分泌受炎癥小體活性的影響并不大，而且他們并沒有在THP-1中重復此發(fā)現(xiàn)


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