發(fā)布時(shí)間：2021-11-01 05:13

　　目的:主要探討PD模型中HtrA2/Omi功能異常與DA神經(jīng)元凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及Wnt信號(hào)通路相關(guān)性的分子機(jī)制,并評(píng)估干預(yù)HtrA2/Omi、Wnt、GSK3β等分子靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)作用。方法:1.采用6羥基多巴胺（6-OHDA）干預(yù)PC12細(xì)胞,構(gòu)建PD細(xì)胞損傷模型,觀察6-OHDA誘導(dǎo)下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力,篩選最佳造模濃度。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)酪氨酸羥化酶（TH）的表達(dá)。流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。利用Western Blot免疫印跡（WB）技術(shù)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白α-syn、CHOP、Grp78、active caspase3、XIAP和TH等蛋白水平的改變。siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染沉默HtrA2/Omi基因,實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)沉默效率。WB法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡蛋白、Wnt通路蛋白。2.CCK8法篩選Ucf101（HtrA2/Omi的特異抑制劑）的最佳濃度。WB法檢測(cè)Ucf101對(duì)PD模型細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響;采用腦立體定位技術(shù)右側(cè)黑質(zhì)致密部（SNc）和中腦腹側(cè)被蓋（VTA）兩點(diǎn)注射6-OHDA法,建造PD大鼠模型。分別于術(shù)后2周、... 

【文章來(lái)源】：新疆醫(yī)科大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：142 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

不同6-OHDA濃度的細(xì)胞形態(tài)（×100）

第一部分·結(jié)果31CON20μM40μM60μM80μM100μM020406080100celviability(ofcontrol)*****圖1-2不同濃度6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響*與對(duì)照組相比，P＜0.05Fig.1-2TheviabilityofPC12cellsindifferentconcentrationsof6-OHDA*comparedwithcontrolgroup，P＜0.05Control3h6h12h24h020406080100****celviability(ofcontrol)圖1-360μmol/L6-OHDA作用于PC12細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性的影響*與對(duì)照組相比，P＜0.05Fig.1-3Effectsof60μmol/L6-OHDAoncellviabilityinPC12cellsatdifferenttimes*comparedwithcontrolgroup，P＜0.05圖1-4TH的免疫組織化學(xué)染色（×200）*與對(duì)照組相比，P＜0.05Fig.1-4immunohistochemistryofTH（×200）*comparedwithcontrolgroup，P＜0.05

新疆醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文322.1.46-OHDA促使α-syn增加，ER應(yīng)激增加，介導(dǎo)DA能神經(jīng)元損傷6-OHDA誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的建立，利用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)α-syn、ERS相關(guān)蛋白CHOP和Grp78、TH蛋白水平的改變。6-OHDA誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型，α-syn、Bip/Grp78和CHOP表達(dá)增加，產(chǎn)生ER應(yīng)激，PD模型細(xì)胞的activecaspase3的表達(dá)水平明顯增加，XIAP、TH的表達(dá)明顯下降，提示線粒體的caspase途徑也參與了PD模型細(xì)胞的凋亡，介導(dǎo)了DA神經(jīng)元損傷，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），（見(jiàn)圖1-5）。圖1-56-OHDA-PD模型細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)*與對(duì)照組相比，P＜0.05Fig.1-5theexpressionofendoplasmicreticulumstressandapoptosis-relatedproteinsin6-6-OHDA-PDmodelcells*comparedwithcontrolgroup，P＜0.05圖A：PD細(xì)胞模型的ER應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，圖B：PD細(xì)胞模型的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。2.1.66-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡6-OHDA作用于PC12細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降，通過(guò)AnnexinⅤ-PE/7AAD試劑盒檢測(cè)模型細(xì)胞的凋亡，檢測(cè)結(jié)果為對(duì)照組凋亡率為3.72±1.35，模型組的凋亡率為24.66±3.54，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，#P＜0.05（見(jiàn)圖1-6）。

【參考文獻(xiàn)】：
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