Fas受體/配體（Fas/FasL）系統(tǒng)在肝細(xì)胞凋亡中起重要作用。當(dāng)FasL與Fas結(jié)合后,會(huì)通過Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（Fas-associated death domain,FADD）傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào),募集procaspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（death-inducing signaling complex,DISC）,隨后激活下游的caspases,從而誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡。表面抗原（HBsAg）是慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者肝臟和外周血中最為豐富的HBV編碼蛋白,且HBsAg在Fas調(diào)控肝細(xì)胞凋亡中的作用目前并未被闡釋,因此本文旨在研究HBsAg對(duì)Fas介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。本研究第一部分旨在探討HBsAg對(duì)Fas介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響。首先我們建立了HepG2-pHBsAg和HepG2-pcDNA3.1混合克隆細(xì)胞株并驗(yàn)證表達(dá)。通過CCK-8、TUNEL以及AnnexinV實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBsAg增加HepG2細(xì)胞對(duì)人Fas單克隆抗體anti-Fas CH11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性,此外HBsAg促進(jìn)anti-Fas CH11和FasL誘導(dǎo)的人原代肝細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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Westernblot及全自動(dòng)免疫熒光分析儀檢測(cè)細(xì)胞株HBsAg表達(dá)A.HepG2-pHBsAg中HBsAg的表達(dá)

福建醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文27圖1-3HBsAg對(duì)anti-FasCH11處理的HepG2細(xì)胞凋亡的影響A.TUNEL檢測(cè)HepG2-pcDNA3.1和HepG2-pHBsAg細(xì)胞株的凋亡。IgM作為anti-FasCH11同型抗體對(duì)照，IgG+IgM作為anti-FasZB4+anti-FasCH11同型抗體對(duì)照。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)200倍視野下的凋亡細(xì)胞，凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。*P<0.05。（存在0.5μg/mlActD處理）。B.AnnexinV檢測(cè)HepG2-pcDNA3.1和HepG2-pHBsAg細(xì)胞株的凋亡。細(xì)胞處理方法同TUNEL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。n=3，*P<0.05。C.HepG2-pRep-HBV，HepG2-pRep-HBV-HBsAg(-)，HepG2-pRep-HBV-HBc&HBx(-)和HepG2-pRep-Sal1細(xì)胞株中，HBsAg、HBc、HBx的表達(dá)。β-tubulin作為內(nèi)參。D.AnnexinV檢測(cè)HepG2-pRep-HBV，HepG2-pRep-HBV-HBsAg(-)，HepG2-pRep-HBV-HBc&HBx(-)和HepG2-pRep-Sal1（對(duì)照）細(xì)胞株的凋亡。1μg/mlanti-FasCH11（存在0.5μg/mlActD）處理4h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。n=3，*P<0.05。4.HBsAg對(duì)anti-FasCH11和FasL介導(dǎo)的人原代肝細(xì)胞凋亡的影響考慮到肝癌細(xì)胞可能具有異常的死亡調(diào)節(jié)途徑，且CH11是人為制備的anti-Fas抗體，可能與其生理狀態(tài)的對(duì)應(yīng)物FasL有所不同。為了更好地驗(yàn)證HBsAg功

福建醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文28能，我們引入人原代肝細(xì)胞PHH并以FasL處理，利用caspase-3/7活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBsAg是否也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為此，我們首先以表達(dá)HBsAg的重組腺病毒Ad-HBsAg以及Ad-GFP（對(duì)照）感染PHH，72h后，在0.5μg/mlActD存在下，以1μg/mlanti-FasCH11或10ng/mlFasL處理細(xì)胞4h，檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3/7的活性，如圖1-4所示，在anti-FasCH11或FasL處理下，Ad-HBsAg組細(xì)胞caspase-3/7活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。提示，HBsAg可促進(jìn)anti-FasCH11和FasL介導(dǎo)的人原代肝細(xì)胞的凋亡。圖1-4HBsAg對(duì)anti-FasCH11和FasL處理的人原代肝細(xì)胞凋亡的影響在1μg/mlanti-FasCH11或10ng/mlFasL處理下（均存在0.5μg/mlActD），caspase-3/7活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ad-GFP和Ad-HBsAg感染PHH中caspase-3/7的活性。n=3，*P<0.05。討論細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝集，胞膜起泡，凋亡小體形成，細(xì)胞碎裂[26]。從生化水平來(lái)看，細(xì)胞凋亡伴隨細(xì)胞外膜磷脂酰絲氨酸外翻，線粒體膜通透性增加，caspase家族蛋白的活化等[27]，可用AnnexinV、TUNEL以及caspase活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。生理狀態(tài)下細(xì)胞凋亡對(duì)于消除異常肝細(xì)胞，維持肝臟穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。但大量細(xì)胞凋亡是急性肝病的特征，而持續(xù)性細(xì)胞凋亡則是慢性肝病的病理學(xué)特征，在這種情況下，肝細(xì)胞凋亡可刺激纖維發(fā)生，最終導(dǎo)致慢性肝病中的肝硬化[28]。引起肝細(xì)胞凋亡的因素包括病毒感染、酒精攝入、膽汁淤積、脂肪變性、藥物濫用和自身免疫等。細(xì)胞凋亡的途徑包括死亡受體依賴性和線粒體依賴性途徑[29,30]。死亡受體依賴的外源性凋亡途徑由死亡配體與其同源受體結(jié)合觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，主要有TNF-


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