本文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在蛇毒鑒定中的探索研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：毒蛇咬傷常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)。在非洲、亞洲、大洋洲和拉丁美洲的農(nóng)村地區(qū),毒蛇咬傷是特別突出的公共衛(wèi)生問題。最近的一項研究估計:全球范圍內(nèi),每年遭受毒蛇咬傷的人數(shù)超過5億,導(dǎo)致25,000-125,000人死亡。在法醫(yī)工作中,懷疑是蛇毒中毒的案件經(jīng)常發(fā)生,確定是否是蛇毒中毒,是哪種蛇毒中毒,是解決該類案件的關(guān)鍵。目前,我國的蛇傷鑒定方法主要是依靠觀察牙痕、癥狀和生化常規(guī)檢查,其中牙痕是關(guān)鍵。但是,在實際工作中又經(jīng)常會碰到?jīng)]有明顯牙痕的案件,這時就得憑經(jīng)驗通過癥狀和生化指標(biāo)來判斷是否是蛇毒中毒、是哪種蛇毒中毒,錯誤判斷的可能性非常大,因此,我們亟需新的鑒定技術(shù)。本研究選擇了中國境內(nèi)常見的4種蛇毒(中華眼鏡蛇毒、五步蛇毒、金環(huán)蛇毒、銀環(huán)蛇毒),運用以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為依托的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展蛇毒的體內(nèi)外蛋白質(zhì)組學(xué)研究,既探索每種蛇毒的高豐度特征毒素蛋白,也探索蛇毒對實驗動物內(nèi)源蛋白質(zhì)的影響,以期獲得蛇毒中毒的生物標(biāo)志物,為蛇傷案件的鑒定提供新方法。主要研究內(nèi)容分為以下3個部分。第一部分中國境內(nèi)4種常見蛇毒的體外蛋白質(zhì)組學(xué)研究為了了解不同蛇毒的蛋白質(zhì)豐度特征,我們將五步蛇毒、眼鏡蛇毒、銀環(huán)蛇毒和金環(huán)蛇毒用胰蛋白酶酶解后以基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測,獲得的肽段數(shù)據(jù)用Max Quant軟件進(jìn)行無標(biāo)記定量。結(jié)果顯示Metalloproteinases、C-type lectins和antithrombin是五步蛇毒中的高豐度蛋白質(zhì),它們的豐度分別為25.4%、24.6%和23.6%;cardiotoxins是眼鏡蛇毒的高豐度蛋白,其豐度達(dá)到了77.1%;在銀環(huán)蛇毒中,beta-bungaratoxin和short neurotoxin homolog NTL4的豐度分別為21.1%和46.6%;在金環(huán)蛇毒中,acetylcholinesterase則以39.8%的豐度居于首位。本部分研究結(jié)果表明不同蛇毒在蛋白質(zhì)組成和豐度上有顯著差異,可以成為法庭科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)蛇傷鑒定的基礎(chǔ)和依據(jù)。第二部分注射蛇毒引起的大鼠血清蛋白變化為了探尋蛇毒導(dǎo)致的血清內(nèi)源蛋白變化,我們從蛋白質(zhì)組學(xué)層面考查了蛇傷時間和蛇毒劑量對血清蛋白質(zhì)的影響。我們選擇了SD大鼠,將4種蛇毒通過腿部肌肉注入大鼠體內(nèi),在預(yù)定的時間點收集血清,血清經(jīng)預(yù)處理后用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測蛋白質(zhì)變化,并用Peaks Studio進(jìn)行i TRAQ 8Plex鑒定和定量,定量信息經(jīng)聚類以尋找隨時間變化表達(dá)量有逐步上調(diào)及下調(diào)趨勢的大鼠蛋白。隨后,這些有明顯變化趨勢的蛋白被進(jìn)行了IPA分析(下游功能效應(yīng)分析、通路分析、調(diào)控趨勢變化、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析)。Peaks Studio的定量結(jié)果進(jìn)一步按照實驗組蛋白強度與對照組蛋白強度的比值0.7或1.33進(jìn)行篩選,以獲得在各組大鼠血清中差異明顯的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示五步蛇毒組大鼠的血清內(nèi)源蛋白變化是本實驗中最多的(83個蛋白),并且主要集中在Fibrinogen、Coagulation factor、Tropomyosin、Tubulin、Myosin等與血液凝固和細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白上;眼鏡蛇毒高濃度組有47個蛋白發(fā)生濃度改變,且低濃度組也有28個蛋白改變了濃度;環(huán)蛇屬的銀環(huán)蛇毒導(dǎo)致的血清內(nèi)源蛋白變化很少,但是在為數(shù)不多的變化了的內(nèi)源蛋白中出現(xiàn)了與神經(jīng)通路相關(guān)的蛋白。這表明不同蛇毒會導(dǎo)致不同的內(nèi)源蛋白發(fā)生變化,相應(yīng)內(nèi)源蛋白的改變則可以與不同的蛇傷聯(lián)系起來。在濃度變化明顯的內(nèi)源蛋白中,有一些蛋白在3個時間點表現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)或持續(xù)下調(diào),在對這些蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的文獻(xiàn)調(diào)查后,我們選出了Retinol-binding protein 4、L-selectin、Troponin I、Protein Z-dependent protease inhibitor作為眼鏡蛇毒中毒的潛在生物標(biāo)志物;Fibrinogen作為五步蛇毒中毒的潛在生物標(biāo)志物;EH domain-containing protein 1作為銀環(huán)蛇毒中毒的潛在生物標(biāo)志物。第三部分注射蛇毒引起的大鼠肌肉蛋白變化為了探尋蛇毒對肌肉組織內(nèi)源蛋白的影響,我們用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了蛇傷動物的肌肉組織。肌肉的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)用Peaks Studio進(jìn)行i TRAQ 8Plex鑒定和定量,并對定量信息進(jìn)行了聚類,尋找上調(diào)和下調(diào)的大鼠蛋白,并對這些有明顯變化趨勢的蛋白進(jìn)行了IPA分析。分析的主要類型包括:功能效應(yīng)分析、通路分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。Peaks Studio的定量結(jié)果進(jìn)一步按照實驗組蛋白強度與對照組蛋白強度的比值0.7或1.33進(jìn)行篩選,以獲得在各組大鼠組織中差異明顯的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)不同蛇毒導(dǎo)致的組織內(nèi)源蛋白變化有明顯不同,同時也發(fā)現(xiàn)了蛇毒成分之一的MPPA在5組大鼠傷口組織中均明顯上調(diào),該蛋白或許可以作為蛇毒中毒的外源標(biāo)志物。五步蛇毒組大鼠的HBA/HBB、LEG5、FGA相對對照組及其它實驗組有顯著高表達(dá),可以考慮作為五步蛇毒中毒的內(nèi)源性潛在生物標(biāo)志物。在銀環(huán)蛇毒組,GC和GELS相對對照組表達(dá)上調(diào),而IPKA、ACSL1、DOPD和ACADV則相對對照組表達(dá)下調(diào),這6個蛋白有望成為銀環(huán)蛇毒中毒的內(nèi)源標(biāo)志物。金環(huán)蛇毒組的FGA和FGB表達(dá)上調(diào)都超過了2倍,其它內(nèi)源蛋白如PLMN、TF、ALB、C9和APOH相對其它4組實驗也具有顯著高表達(dá),有望作為金環(huán)蛇咬傷的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。在眼鏡蛇毒組大鼠組織中,GELS、HSP71、ATN2和SYNPO均有顯著的差異表達(dá),可以作為潛在的標(biāo)志因子用眼鏡蛇咬傷的診斷。本課題運用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)首次系統(tǒng)研究了中國境內(nèi)常見的4種蛇毒(五步蛇毒、中華眼鏡蛇毒、金環(huán)蛇毒、銀環(huán)蛇毒),以及蛇毒對生物血清和組織內(nèi)源蛋白質(zhì)的影響,獲得了蛇毒產(chǎn)生毒性作用的生物學(xué)通路和蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并通過對內(nèi)源蛋白質(zhì)濃度變化數(shù)據(jù)的嚴(yán)格篩選,獲得了4種蛇毒中毒的潛在生物標(biāo)志物,為法醫(yī)蛇傷案件鑒定方法的進(jìn)一步深入研究提供了新方法和新思路。
【關(guān)鍵詞】：蛇毒 蛋白質(zhì)組學(xué) 血清 生物標(biāo)志物 質(zhì)譜
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：D919
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 引言12-18
• 參考文獻(xiàn)15-18
• 第一部分 中國境內(nèi)4種常見蛇毒的體外蛋白質(zhì)組學(xué)研究18-36
• 1. 材料與方法19-21
• 2. 結(jié)果與討論21-32
• 3. 結(jié)論32-36
• 第二部分 注射蛇毒引起的大鼠血清蛋白變化36-73
• 1. 材料與方法37-41
• 2. 結(jié)果與討論41-72
• 3. 結(jié)論72-73
• 第三部分 注射蛇毒引起的大鼠肌肉蛋白變化73-93
• 1. 材料與方法73-76
• 2. 結(jié)果與討論76-92
• 3. 結(jié)論92-93
• 結(jié)語93-96
• 參考文獻(xiàn)96-111
• 綜述111-131
• 參考文獻(xiàn)124-131
• 攻讀博士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)成果131-132
• 致謝132-133

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在蛇毒鑒定中的探索研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：342532