發(fā)布時(shí)間：2017-05-03 08:06

  本文關(guān)鍵詞：ATF6在增加慢性缺氧心肌耐受急性缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:缺氧是心血管疾病最常見的病理生理改變,長期慢性低氧不僅存在于高海拔地區(qū),而且也常見于紫紺型先天性心臟病和慢性缺血性心臟病(chronic ischemia heart disease,CIHD)。既往流行病學(xué)證據(jù)顯示長期居住在高海拔地區(qū)的人群有較少的CIHD發(fā)生率及更低的心臟疾病死亡率。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明,慢性間斷缺氧的心肌能更好的耐受急性缺血/缺氧損害。此外,長期臨床觀察也發(fā)現(xiàn),某些紫紺型先心病患兒雖然心臟長期被低氧的血液灌注,但在一定時(shí)期內(nèi)仍能存活,且很少發(fā)生心力衰竭,并能抵御心臟外科手術(shù)所致的缺血缺氧損害。上述現(xiàn)象表明長期慢性低氧可能誘導(dǎo)了心肌內(nèi)在的適應(yīng)性變化,且這種變化對心肌具有保護(hù)作用。然而,產(chǎn)生這種保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全清楚,因此,深入研究慢些缺氧誘導(dǎo)心肌保護(hù)的分子機(jī)制將有益于提高心肌保護(hù)策略,改善心臟外科手術(shù)圍術(shù)期缺血缺氧所致心肌損害的治療水平。低氧可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)�；罨霓D(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)是一個(gè)由670個(gè)氨基酸組成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜II型跨膜蛋白質(zhì),在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。ATF6在反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)時(shí)被裂解成具有活性的轉(zhuǎn)錄因子并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,活化一系列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)基因從而發(fā)揮作用。最新研究表明在慢性應(yīng)激時(shí),ATF6具有促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)并保護(hù)細(xì)胞免受慢性應(yīng)激損害,可見ATF6具有細(xì)胞保護(hù)及促細(xì)胞生存的特性。前期我們研究發(fā)現(xiàn)在紫紺型先心病患兒心肌組織ATF6持續(xù)活化,提示其可能在慢性缺氧心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著維持自我適應(yīng)及保護(hù)作用。但是,其潛在保護(hù)作用及確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。大量研究已闡明Akt,亦稱蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)在維持心肌細(xì)胞生存和心肌保護(hù)中的重要性。最近研究也發(fā)現(xiàn)慢性缺氧誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞Akt的表達(dá)并參與了減輕心肌細(xì)胞缺血缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)機(jī)制。UPR和Akt通路長期以來被認(rèn)為在特殊條件下具有調(diào)節(jié)和影響細(xì)胞命運(yùn)的功能,但是作為UPR反應(yīng)分支之一的ATF6與Akt通路在功能上的聯(lián)系僅在最近才有所報(bào)道。然而,Akt是否涉及ATF6參與的慢性缺氧心肌耐受急性缺血再灌注(ischemia/reperfusion,i/r)損傷尚未見報(bào)道。因而,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來闡明。研究意義:本研究擬構(gòu)建慢性缺氧刺激的動(dòng)物模型,檢測慢性缺氧心肌atf6的表達(dá)情況;通過在體和離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證慢性缺氧刺激對心肌耐受急性i/r損傷的效果,進(jìn)一步從細(xì)胞水平探討atf6在慢性缺氧增加心肌耐受急性i/r損傷中的作用,并采用sirna技術(shù)闡明atf6可能通過調(diào)控akt信號(hào)通路而發(fā)揮這種作用。研究內(nèi)容:1.構(gòu)建慢性缺氧刺激的動(dòng)物模型并檢測atf6在慢性缺氧心肌的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)以健康雄性sprague-dawley(sd)大鼠為研究對象,建立慢性缺氧動(dòng)物模型。將sd大鼠隨機(jī)分為兩組:常氧組和慢性缺氧組。常氧組大鼠在常氧環(huán)境(78%n2、21%o2)下喂養(yǎng),缺氧組大鼠在模擬海拔5000米小動(dòng)物低壓低氧艙內(nèi)喂養(yǎng)(艙內(nèi)大氣壓404mmhg、氧分壓84.98mmhg、溫度25℃)。4周后,獲取大鼠,檢測大鼠體重及心臟重量、血氧指標(biāo)、血紅蛋白濃度及紅細(xì)胞比積來評估缺氧程度。采用免疫熒光染色及westernblot技術(shù)檢測缺氧心肌組織atf6及其下游基因grp78/bip的表達(dá)情況。2.研究慢性缺氧刺激對心肌耐受急性i/r損傷的效果。建立心肌急性i/r模型。通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立在體急性心肌i/r損傷模型,超聲測量兩組大鼠缺血前和再灌注24h后心功能變化、檢測血液心肌酶學(xué)指標(biāo)變化以及ttc染色了解心肌壞死程度來評估慢性缺氧對心肌耐受急性i/r損傷的影響;以langendorff灌流系統(tǒng)建立離體心臟急性i/r損傷模型,監(jiān)測兩組大鼠缺血前和再灌注后左心室內(nèi)壓力變化、檢測灌流液ldh活性以及ttc染色了解心肌壞死程度來研究慢性缺氧在促心肌耐受急性i/r損傷中的作用。3.探討atf6在增加慢性缺氧心肌耐受急性i/r中的作用及可能機(jī)制。利用h9c2心肌細(xì)胞株,建立慢性低氧細(xì)胞模型。將h9c2心肌細(xì)胞在氧濃度為13%o2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h,采用westernblot技術(shù)檢測上述5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)缺氧對心肌細(xì)胞內(nèi)atf6、grp78/bip及akt/p-akt表達(dá)的影響。建立i/r細(xì)胞模型,h9c2細(xì)胞分為常氧和低氧培養(yǎng)兩組,培養(yǎng)48h(即缺氧誘導(dǎo)atf6表達(dá)最高時(shí)間點(diǎn))后,將兩組h9c2細(xì)胞置于模擬的缺血培養(yǎng)液培養(yǎng)1h后轉(zhuǎn)移到常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3h,cck-8細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞活性了解細(xì)胞存活狀態(tài),檢測釋放到培養(yǎng)基的ldh活性了解細(xì)胞壞死程度以評估缺氧對心肌細(xì)胞耐受急性i/r損傷的影響。采用sirna技術(shù),將sirna質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到h9c2細(xì)胞在常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h后給予細(xì)胞模擬i/r處理,檢測細(xì)胞活性和培養(yǎng)基ldh活性來說明atf6在增加慢性缺氧耐受急性i/r損傷的作用;檢測細(xì)胞grp78/bip及akt/p-akt的表達(dá)變化,說明atf6發(fā)揮此種作用的可能機(jī)制。研究結(jié)果:1.實(shí)驗(yàn)前兩組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,經(jīng)過4周缺氧暴露,慢性缺氧組大鼠體重、血氧分壓及氧飽和度明顯低于常氧組,而心臟重量、血紅蛋白水平、紅細(xì)胞比積及心臟重/體重則明顯高于常氧組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.在體大鼠急性i/r模型中,盡管慢性缺氧導(dǎo)致心臟收縮功能有所下降,表現(xiàn)為缺血前低氧組大鼠ef及fs低于常氧組,分別給予兩組大鼠缺血30min隨之再灌注24h處理后,兩組大鼠心臟收縮功能均下降,但缺氧組ef及fs下降程度較常氧組小,且高于常氧組;再灌注24h后血清ck-mb活性低于常氧組,心肌梗塞面積小于常氧組,表明缺血前慢性缺氧處理能較好地保留i/r后心臟收縮功能,減少心肌損害。3.langendorff離體心臟灌流模型中,在缺血前慢性缺氧組心臟較常氧組心臟lvdp要低,但經(jīng)30min缺血隨后再灌注的10min、20min、30min、40min、50min及60min各個(gè)時(shí)間點(diǎn)lvdp在缺氧組要明顯高于常氧組;再灌注60min后測定灌流液ldh活性及心肌梗塞面積均小于常氧組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明缺血前慢性缺氧處理能促進(jìn)再灌注后心功能恢復(fù),降低心肌i/r損害。4.westernblot檢測慢性缺氧組大鼠心肌組織活化型atf6α(50kda)表達(dá)顯著高于常氧組,而且缺氧組左室及右室心肌組織中atf6α的表達(dá)無差異,免疫熒光檢測也顯示了低氧左室及右室心肌組織atf6α的表達(dá)顯著增加。h9c2心肌細(xì)胞低氧培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)atf6α于缺氧24h開始表達(dá)上調(diào),與0h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而且隨著缺氧時(shí)間的延長,其表達(dá)量也逐漸增加。westernblot檢測grp78/bip在心肌組織和h9c2心肌細(xì)胞的表達(dá)與atf6α呈相同趨勢變化。5.中度低氧培養(yǎng)誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞atf6表達(dá)增加,采用sirna-atf6質(zhì)粒抑制atf6表達(dá)后,低氧不能誘導(dǎo)atf6α表達(dá)上調(diào),選擇atf6α高表達(dá)時(shí)間點(diǎn)給予h9c2心肌細(xì)胞模擬缺血1h后再灌注3h處理,檢測心肌細(xì)胞活力及培養(yǎng)基ldh活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在模擬缺血1h后再灌注3h其活力較常氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞要高,而ldh活性則低于常氧處理組。然而,利用sirna干擾atf6表達(dá)后同樣地給予細(xì)胞模擬i/r,則出現(xiàn)相反結(jié)果,即低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞活力較常氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞要低,ldh活性高于常氧處理組。結(jié)果表明,長時(shí)間低氧處理可以增加心肌細(xì)胞耐受隨后的急性i/r損傷,而且是atf6參與了這種保護(hù)作用。6.為了闡明ATF6參與慢性缺氧增加心肌細(xì)胞耐受急性I/R損傷的可能機(jī)制,我們檢測了Akt信號(hào)通路。發(fā)現(xiàn)中度低氧誘導(dǎo)了H9c2心肌細(xì)胞p-Akt表達(dá)上調(diào),其表達(dá)變化規(guī)律與ATF6及Bip一致,利用si RNA干擾ATF6表達(dá)并低氧誘導(dǎo)48h后檢測p-Akt結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)被抑制。結(jié)果表明,ATF6參與慢性缺氧增加心肌耐受急性I/R損傷的分子機(jī)制可能涉及到Akt信號(hào)通路。結(jié)論1、本研究成功構(gòu)建了慢性缺氧大鼠模型。通過對大鼠體重、心臟重量、心臟重/體重、血氧指標(biāo)、血紅蛋白濃度及紅細(xì)胞比積等生理參數(shù)變化來評估低氧程度,發(fā)現(xiàn)該模型比較符合紫紺型先心病的長期慢性缺氧特點(diǎn),因此可將此模型用于紫紺型先心病缺氧相關(guān)的基礎(chǔ)研究。2、慢性缺氧誘導(dǎo)了大鼠心肌組織及H9c2心肌細(xì)胞ATF6α及下游基因GRP78/Bip的表達(dá)上調(diào),在低氧培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞中隨著缺氧時(shí)間延長二者表達(dá)也逐漸增加。3、在體大鼠急性I/R模型中,慢性缺氧能較好地保留大鼠心臟急性I/R后的心肌收縮功能,減少了心肌損害;Langendorff離體心臟灌流模型中,慢性缺氧預(yù)處理能促進(jìn)大鼠心臟I/R后心功能恢復(fù)。慢性缺氧有助于增加心肌對急性I/R損傷的耐受。4、慢性缺氧增加了H9c2心肌細(xì)胞耐受急性I/R損傷,ATF6參與了長時(shí)間慢性低氧誘導(dǎo)的這種心肌保護(hù)作用。5、慢性低氧培養(yǎng)誘導(dǎo)了H9c2心肌細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)上調(diào),采用si RNA干擾ATF6α表達(dá)后低氧培養(yǎng)不能誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞p-Akt表達(dá),且低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞對急性I/R損傷耐受性降低。ATF6在發(fā)揮慢性缺氧適應(yīng)增加心肌耐受急性I/R損傷中的保護(hù)效應(yīng)可能是通過Akt通路實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：活化的轉(zhuǎn)錄因子6 慢性缺氧 缺血再灌注損傷 蛋白激酶B(Akt)/磷酸化Akt(p-Akt)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R654.2
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 第二章 慢性缺氧動(dòng)物模型構(gòu)建及ATF6 在慢性缺氧心肌的表達(dá)變化18-30
• 2.1 材料和方法19-24
• 2.2 結(jié)果24-28
• 2.3 討論28-30
• 第三章 慢性缺氧促心肌耐受急性缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究30-50
• 3.1 材料和方法31-35
• 3.2 結(jié)果35-47
• 3.3 討論47-50
• 第四章 ATF6在增加慢性缺氧心肌耐受急性缺血再灌注損傷中的作用研究50-69
• 4.1 材料和方法51-58
• 4.2 結(jié)果58-66
• 4.3 討論66-69
• 全文結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-78
• 文獻(xiàn)綜述一 慢性缺氧誘導(dǎo)心肌保護(hù)分子機(jī)制研究進(jìn)展78-92
• 參考文獻(xiàn)84-92
• 文獻(xiàn)綜述二 ATF6 及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)在心臟中的作用92-105
• 參考文獻(xiàn)99-105
• 博士研究生期間撰寫和發(fā)表的文章105-106
• 致謝106

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 謝婧雯;劉曉燕;;Akt信號(hào)通路在紫紺型先天性心臟病患兒心肌慢性缺氧適應(yīng)中的作用[J];臨床心血管病雜志;2012年05期

  本文關(guān)鍵詞：ATF6在增加慢性缺氧心肌耐受急性缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：342637