發(fā)布時(shí)間：2021-10-07 18:24

　　膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis,KOA）是多因素所導(dǎo)致的中老年人常見病和多發(fā)病,嚴(yán)重影響中老年人的身體健康和生活質(zhì)量。軟骨細(xì)胞退變是KOA發(fā)病的基礎(chǔ),而力學(xué)因素在軟骨細(xì)胞退變中的作用機(jī)制一直以來都是研究的熱點(diǎn)。本研究在力學(xué)刺激干預(yù)后軟骨細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究與力學(xué)刺激密切相關(guān)的整合素、Hippo/YAP信號通路變化,以及理筋手法干預(yù)后上述信號通路變化的規(guī)律,以期明確中醫(yī)傳統(tǒng)手法治療KOA的作用機(jī)理。第一部分周期性壓應(yīng)力下膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的:應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)觀察周期性壓力干預(yù)下KOA軟骨細(xì)胞蛋白質(zhì)差異表達(dá)變化。方法:將二周齡雄性SD大鼠,隨機(jī)分為正常組、模型組和壓力組,每組4只。正常組在常規(guī)的培養(yǎng)環(huán)境下,應(yīng)用常規(guī)的壓力進(jìn)行培養(yǎng);模型組在常規(guī)壓力條件下,在培養(yǎng)基中加入TNF-α試劑模擬OA炎癥環(huán)境培養(yǎng);壓力組在培養(yǎng)基中應(yīng)用TNF-α刺激軟骨細(xì)胞模擬OA炎癥環(huán)境下,應(yīng)用Flexcell-5000細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力加載系統(tǒng)予以172k Pa、2Hz的周期性壓應(yīng)力,時(shí)間為60 min/d,連續(xù)干預(yù)3天。應(yīng)用液相色譜-質(zhì)... 

【文章來源】：上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)流程示例圖

Ｃ扛?0min，將標(biāo)本振搖60次，于3h后應(yīng)用200目細(xì)胞篩1200rpm，然后離心10min，將離心后的細(xì)胞用含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行接種，放入5％CO2，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h后觀察細(xì)胞貼壁情況，次日將標(biāo)本細(xì)胞應(yīng)用PBS清洗數(shù)次，然后更換新的含抗培養(yǎng)基，密切觀察細(xì)胞融合度，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90％以后，更換培養(yǎng)基；次日上午應(yīng)用PBS清洗，加入0.25％胰蛋白酶1mL覆蓋細(xì)胞，再將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱內(nèi)消化5min，最后加入3mL培養(yǎng)基終止消化；500rpm，5min離心后，沉淀細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸，再按比例進(jìn)行傳代。圖1-2大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞取材

上海中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文101.5.2大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞鑒定分別應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色法和Ⅱ型膠原免疫組化染色法對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。（1）甲苯胺藍(lán)染色法鑒定軟骨細(xì)胞表型軟骨細(xì)胞爬片48h，應(yīng)用配置的PBS溶液進(jìn)行沖洗，然后再用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，固定時(shí)間為30min，再用1%的甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色30min，最后用無水乙醇進(jìn)行沖洗，將涂片置于空氣中干燥，中性樹脂封片，鏡下觀察。（2）Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化染色法鑒定軟骨細(xì)胞表型制作細(xì)胞爬片，常規(guī)培養(yǎng)48h，嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。具體步驟如下：①傾去培養(yǎng)液，應(yīng)用冰PBS漂洗3次，每次3min，然后加入4%多聚甲醛1ml，在室溫固定15min。②應(yīng)用PBS溶液反復(fù)漂洗標(biāo)本3次，每次3min，然后滴加3％H202，室溫下孵育10min。③應(yīng)用PBS溶液反復(fù)漂洗標(biāo)本3次，每次3min，滴加穿膜液0.5ml(0.1％timton+0.1MGlycine)冰上孵育30min。④應(yīng)用PBS溶液反復(fù)漂洗標(biāo)本3次，加入BSA0.5ml，室溫下封閉1h。⑤在封口膜上滴加的兔抗大鼠II型膠原多克隆抗體50ul（1：150稀釋），然后放在濕盒中4℃過夜。⑥PBS反復(fù)漂洗，加入二抗工作液，37℃孵育20min；PBS反復(fù)漂洗，加1滴SABC試劑，37℃孵育20min，PBS反復(fù)漂洗。最后DAB顯色蘇木素輕度復(fù)染，脫水，干燥，封片，電子顯微鏡下觀察。圖1-3軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化染色如圖1-3所示：顯微鏡下觀察，軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色其細(xì)胞內(nèi)表呈現(xiàn)紫紅


本文編號：3422547