發(fā)布時間：2021-10-07 18:24

　　膝關節(jié)骨性關節(jié)炎（Knee Osteoarthritis,KOA）是多因素所導致的中老年人常見病和多發(fā)病,嚴重影響中老年人的身體健康和生活質量。軟骨細胞退變是KOA發(fā)病的基礎,而力學因素在軟骨細胞退變中的作用機制一直以來都是研究的熱點。本研究在力學刺激干預后軟骨細胞差異表達蛋白質組學研究研究的基礎上,進一步研究與力學刺激密切相關的整合素、Hippo/YAP信號通路變化,以及理筋手法干預后上述信號通路變化的規(guī)律,以期明確中醫(yī)傳統(tǒng)手法治療KOA的作用機理。第一部分周期性壓應力下膝骨關節(jié)炎軟骨細胞差異表達蛋白質組學研究目的:應用蛋白組學技術觀察周期性壓力干預下KOA軟骨細胞蛋白質差異表達變化。方法:將二周齡雄性SD大鼠,隨機分為正常組、模型組和壓力組,每組4只。正常組在常規(guī)的培養(yǎng)環(huán)境下,應用常規(guī)的壓力進行培養(yǎng);模型組在常規(guī)壓力條件下,在培養(yǎng)基中加入TNF-α試劑模擬OA炎癥環(huán)境培養(yǎng);壓力組在培養(yǎng)基中應用TNF-α刺激軟骨細胞模擬OA炎癥環(huán)境下,應用Flexcell-5000細胞牽張拉伸應力加載系統(tǒng)予以172k Pa、2Hz的周期性壓應力,時間為60 min/d,連續(xù)干預3天。應用液相色譜-質... 

【文章來源】：上海中醫(yī)藥大學上海市

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

實驗流程示例圖

Ｃ扛?0min，將標本振搖60次，于3h后應用200目細胞篩1200rpm，然后離心10min，將離心后的細胞用含20％FBS的DMEM培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)瓶中進行接種，放入5％CO2，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h后觀察細胞貼壁情況，次日將標本細胞應用PBS清洗數(shù)次，然后更換新的含抗培養(yǎng)基，密切觀察細胞融合度，當細胞融合度達到90％以后，更換培養(yǎng)基；次日上午應用PBS清洗，加入0.25％胰蛋白酶1mL覆蓋細胞，再將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱內消化5min，最后加入3mL培養(yǎng)基終止消化；500rpm，5min離心后，沉淀細胞用完全培養(yǎng)基重懸，再按比例進行傳代。圖1-2大鼠膝關節(jié)軟骨細胞取材

上海中醫(yī)藥大學博士學位論文101.5.2大鼠膝關節(jié)軟骨細胞鑒定分別應用甲苯胺藍染色法和Ⅱ型膠原免疫組化染色法對大鼠膝關節(jié)軟骨細胞進行鑒定。（1）甲苯胺藍染色法鑒定軟骨細胞表型軟骨細胞爬片48h，應用配置的PBS溶液進行沖洗，然后再用4%的多聚甲醛進行固定，固定時間為30min，再用1%的甲苯胺藍進行染色30min，最后用無水乙醇進行沖洗，將涂片置于空氣中干燥，中性樹脂封片，鏡下觀察。（2）Ⅱ型膠原免疫細胞化染色法鑒定軟骨細胞表型制作細胞爬片，常規(guī)培養(yǎng)48h，嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行操作。具體步驟如下：①傾去培養(yǎng)液，應用冰PBS漂洗3次，每次3min，然后加入4%多聚甲醛1ml，在室溫固定15min。②應用PBS溶液反復漂洗標本3次，每次3min，然后滴加3％H202，室溫下孵育10min。③應用PBS溶液反復漂洗標本3次，每次3min，滴加穿膜液0.5ml(0.1％timton+0.1MGlycine)冰上孵育30min。④應用PBS溶液反復漂洗標本3次，加入BSA0.5ml，室溫下封閉1h。⑤在封口膜上滴加的兔抗大鼠II型膠原多克隆抗體50ul（1：150稀釋），然后放在濕盒中4℃過夜。⑥PBS反復漂洗，加入二抗工作液，37℃孵育20min；PBS反復漂洗，加1滴SABC試劑，37℃孵育20min，PBS反復漂洗。最后DAB顯色蘇木素輕度復染，脫水，干燥，封片，電子顯微鏡下觀察。圖1-3軟骨細胞甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫細胞化染色如圖1-3所示：顯微鏡下觀察，軟骨細胞甲苯胺藍染色其細胞內表呈現(xiàn)紫紅


本文編號：3422547