發(fā)布時(shí)間：2017-05-02 22:12

  本文關(guān)鍵詞：膽囊結(jié)石疾病的生物信息學(xué)研究及其分子調(diào)控機(jī)制的探索，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在我國(guó),膽囊結(jié)石病是一種常見的普通外科疾病,全世界的患病率約為15%左右,它是引起重癥膽道感染的主要原因,與急性重癥胰腺炎的關(guān)系十分密切,更是膽囊癌形成和發(fā)展的潛在因素。膽囊結(jié)石成因的分子機(jī)制尚未完全明了,目前普遍認(rèn)為是遺傳因素、環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)膽囊結(jié)石形成機(jī)制的探索和研究最終形成了三個(gè)一致的基本共識(shí),已經(jīng)成為膽石病的經(jīng)典假說(shuō)：① 膽汁中膽固醇過(guò)飽和,是膽囊結(jié)石發(fā)生的必要條件與膽石形成的基礎(chǔ)；② 膽汁中促/抗成核因子平衡的破壞,導(dǎo)致膽固醇單水結(jié)晶的形成；③ 膽囊動(dòng)力異常及功能的障礙,參與并促進(jìn)膽囊結(jié)石的發(fā)生。miRNAs近些年來(lái)已被證實(shí)來(lái)對(duì)許多疾病具有調(diào)控作用,但是在膽囊結(jié)石病中,尚未見到相關(guān)報(bào)道。因此,本研究采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)通過(guò)對(duì)膽囊結(jié)石患者膽囊粘膜中mRNA和niRNA表達(dá)譜的檢測(cè)及生物信息學(xué)的分析,初步了解niRNAmRNA在其可能的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,并在體外細(xì)胞模型中對(duì)其分子機(jī)理進(jìn)行初步的探索。1,利用Hiseq deep sequencing新一代高通量深度測(cè)序技術(shù)對(duì)膽囊結(jié)石和膽囊息肉患者的膽囊上皮樣本中mRNA進(jìn)行檢測(cè),比對(duì)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù),檢測(cè)了mRNA表達(dá)情況,利用DAVID網(wǎng)站整合數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)2倍法篩選的差異基因進(jìn)行基因本體學(xué)(GO)、 KEGG信號(hào)通路KEGG pathway)分析,對(duì)差異基因的功能富集情況和信號(hào)通路富集情況進(jìn)行描述。2,以上述同樣總RNA為材料,使用Hiseq高通量測(cè)序法建立miRNA文庫(kù),獲取miRNA的表達(dá)譜。對(duì)比miRBase數(shù)據(jù)庫(kù),利用targetscan網(wǎng)站提供的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)2倍法篩選的miRNA差異基因進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。對(duì)預(yù)測(cè)獲得的靶基因利用DAVID網(wǎng)站進(jìn)行GO及KEGG信號(hào)通路分析,對(duì)預(yù)測(cè)靶基因的功能富集情況和信號(hào)通路富集情況進(jìn)行描述。3,對(duì)比分析miRN A和mRNA兩者之間表達(dá)差異的基因(差異表達(dá)miRNA的定義為：Fold-change1或者Fold-change-1,并且p-value0.01;差異表達(dá)mRNA的定義為：FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍及以上的基因),采用生物信息學(xué)的方法,分析并構(gòu)建了構(gòu)建膽囊結(jié)石差異miRNA和mRNA表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選驗(yàn)證研究方向。4,應(yīng)用Real-time PCR方法,隨機(jī)驗(yàn)證了miRNA和mRNA在膽囊結(jié)石和膽囊息肉患者的膽囊上皮組織中的表達(dá)情況,對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。5,對(duì)篩選出的miRNA和mRNA,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因法,在體外細(xì)胞模型中過(guò)表達(dá)miRNA等方法進(jìn)一步分析其調(diào)控機(jī)制。同時(shí)利用western-blot方法對(duì)篩選出的信號(hào)通路進(jìn)行初步的檢測(cè),為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。結(jié)果：1,膽囊結(jié)石和膽囊息肉mRNAs的Hiseq高通量測(cè)序比對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果顯示,差異表達(dá)的mRNA差異基因共有525條。GO分析發(fā)現(xiàn),這些基因在細(xì)胞發(fā)育、結(jié)構(gòu)發(fā)育、細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞組分機(jī)化調(diào)控方面具有重要作用。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)具有顯著性差異的為WNT、MAPK、PI3K/AKT等癌細(xì)胞信號(hào)通路,離子轉(zhuǎn)運(yùn)通路,胰島素相關(guān)通路等。2,膽囊結(jié)石和膽囊息肉miRNAs的Hiseq高通量測(cè)序比對(duì)miRNA表達(dá)譜中共有差異基因17個(gè),通過(guò)targetscan網(wǎng)站獲得預(yù)測(cè)靶基因1962個(gè),通過(guò)DAVID網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn),預(yù)測(cè)靶基因在發(fā)育過(guò)程,生物調(diào)節(jié),細(xì)胞過(guò)程,細(xì)胞組分機(jī)化,生長(zhǎng),生物粘附等方面有富集；KEGG通路分析提示,基因富集具有顯著性差異的通路總計(jì)29條,去除與腫瘤相關(guān)的通路后共剩余16條通路。其中大部分在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族方面均有研究,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控通路富集最為顯著。通過(guò)miranda v3.3a軟件預(yù)測(cè)顯著性差異表達(dá)的17個(gè)miRNAs的靶基因,發(fā)現(xiàn)幾乎每個(gè)miRNA都對(duì)應(yīng)眾多的靶基因,我們最終選取所預(yù)測(cè)的target中energy最低的10個(gè)基因構(gòu)建了miRNA及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3,膽囊結(jié)石和膽囊息肉中mRNA和miRNA聯(lián)合分析結(jié)合差異表達(dá)mRNA與miRNA進(jìn)行整合分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了17個(gè)miRNA所預(yù)測(cè)的靶基因占據(jù)了mRNA高通量測(cè)序結(jié)果的87%。隨后我們利用DAVID對(duì)差異表達(dá)miRNA調(diào)控的表達(dá)上調(diào)和上調(diào)的重復(fù)性靶基因進(jìn)行GO和Pathway分析。GO分析結(jié)果顯示,受miRNA的所有表達(dá)差異顯著性的基因中,只有7個(gè)有GO分類,并且都屬于GO分類中的cellular component,即Cytoplasm和Cytoplasmic part。Pathway分析結(jié)果顯示,受miRNAs調(diào)控的114個(gè)靶基因中,有28個(gè)屬于45個(gè)pathway分類。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),這些差異表達(dá)的miRNA所預(yù)測(cè)的靶基因只有一個(gè)也在mRNA測(cè)序結(jié)果中具有顯著性差異表達(dá)——miR-210 和 ATP11a。4,熒光定量PCR對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證通過(guò)熒光定量PCR方法對(duì)隨機(jī)選擇的ATP 11 A, TRDN, IFI27, MYL3, RPS4Y1, USP9Y, AMH, SLC28A2和miR-192, miR-133a, miR-210, miR-200c, miR-194, miR-891a進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示各niRNA和mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與高通量測(cè)序結(jié)果一致。5,miR及其靶基因在膽囊上皮細(xì)胞中的調(diào)控雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-210及其靶基因ATPlla的關(guān)系,膽囊上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-210后,ATP11a的表達(dá)量明顯降低。結(jié)論：我們?cè)?0對(duì)樣本中明確了17個(gè)差異表達(dá)的miRNA和525個(gè)差異表達(dá)的mRNA,他們多富集于在細(xì)胞粘附、發(fā)育、凋亡等方面,與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、胰島素相關(guān)通路、免疫系統(tǒng)通路等有關(guān)聯(lián)性。二者聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)了17個(gè)差異表達(dá)的miRNA以及114個(gè)共表達(dá)的mRNA。最終確定了同為顯著性差異表達(dá)的miR-210和它的靶基因ATP11a。
【關(guān)鍵詞】：膽囊結(jié)石 microRNA mRNA 聯(lián)合分析 靶基因驗(yàn)證 分子機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R657.42
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 主要英文縮略詞表12-13
• 前言13-15
• 第一部分 膽囊結(jié)石和膽囊息肉患者mRNAs的檢測(cè)15-77
• 引言15
• 1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-24
• 3 結(jié)果24-74
• 4. 討論74-77
• 第二部分 膽囊結(jié)石和膽囊息肉患者microRNAs的檢測(cè)及與mRNA表達(dá)譜的聯(lián)合分析77-114
• 1 實(shí)驗(yàn)材料77-78
• 2 實(shí)驗(yàn)方法78-82
• 3 結(jié)果82-111
• 4 討論111-114
• 第三部分 高通量測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證114-125
• 1 材料114-115
• 2 方法115-120
• 3 結(jié)果120-124
• 4 討論124-125
• 第四部分miR-210和鉛基因ATP11的驗(yàn)證及對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控125-147
• 1 材料125-127
• 2 方法127-138
• 3 結(jié)果138-142
• 4 討論142-147
• 全文總結(jié)147-148
• 參考文獻(xiàn)148-156
• 文獻(xiàn)綜述156-168
• 參考文獻(xiàn)162-168
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章168
• 參與科研項(xiàng)目168
• 獲獎(jiǎng)情況168-169
• 致謝169

【引證文獻(xiàn)】

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 袁洪;唐斌;黃志軍;陽(yáng)國(guó)平;崔嶸;;原發(fā)性高脂血癥人群中SLCO1B1基因的分布[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第十次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2008年

  本文關(guān)鍵詞：膽囊結(jié)石疾病的生物信息學(xué)研究及其分子調(diào)控機(jī)制的探索，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：341791