目的:疫苗的使用已大幅降低乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）的感染,但其仍然是全球嚴(yán)重的健康問(wèn)題,受累人數(shù)超過(guò)3.5億�，F(xiàn)有的治療手段存在療程長(zhǎng)、副作用大、病毒逃逸等問(wèn)題,導(dǎo)致HBV感染者的治愈率低。目前對(duì)HBV缺乏有效的治療手段主要因?yàn)閷?duì)其生活周期缺乏了解。HBV進(jìn)入肝細(xì)胞是整個(gè)生活周期的重要部分,對(duì)此過(guò)程及其機(jī)制的探討可能對(duì)其新藥研發(fā)提供新的思路。研究發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞主要表達(dá)的鈣黏素E-cadherin與病原體的感染存在相關(guān)性。本研究主要探討E-cadherin對(duì)HBV感染肝細(xì)胞的影響及機(jī)制。方法:1、E-cadherin在HBV感染肝細(xì)胞中的作用1.1本研究所用的細(xì)胞模型、HBV顆粒和HBV假病毒本研究共用三種細(xì)胞模型:穩(wěn)定表達(dá)NTCP的Hep G2-NTCP細(xì)胞、已分化為肝細(xì)胞的Hepa RG細(xì)胞及人肝原代細(xì)胞（primary human hepatocytes,PHH）。已知它們均可被HBV感染,均表達(dá)E-cadherin;通過(guò)檢測(cè)、比較Hepa RG和Hep G2-NTCP細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)水平,我們發(fā)現(xiàn)Hepa RG細(xì)胞的E-cadheri... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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siRNA-E-cadherin對(duì)E-cadherin的敲低效率

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文38胞的HepaRG細(xì)胞以及PHH細(xì)胞作為細(xì)胞模型。細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、下調(diào)E-cadherin組、下調(diào)NTCP組和同時(shí)下調(diào)E-cadherin和NTCP組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNAs3d后，加入eHBV感染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染siRNAs48h后，提取總RNA檢測(cè)E-cadherin和NTCP的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)在HepG2-NTCP和HepaRG細(xì)胞中，siRNA對(duì)E-cadherin和NTCP的敲低效率達(dá)到甚至超過(guò)50%（P<0.01），提示目前所用的siRNA有較好的敲低效率，見(jiàn)圖1.1和1.2。圖1.1siRNA-E-cadherin對(duì)E-cadherin的敲低效率Fig1.1SilencingefficacyofE-cadherinwasassessed圖1.2siRNA-NTCP對(duì)NTCP的敲低效率

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文39Fig1.2SilencingefficacyofNTCPwasassessed轉(zhuǎn)染siRNA后，連續(xù)檢測(cè)24、48和72h的CCK8值，結(jié)果提示siRNA-NC、siRNA-E-cadherin和siRNA-NTCP對(duì)細(xì)胞增殖的影響不明顯（P>0.05），見(jiàn)圖1.3。圖1.3si-NC、si-E-cadherin和si-NTCP的轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig1.3Theeffectoftranfectingsi-RNAs,si-E-cadherinandsi-NTCPonthecellproliferation感染eHBV2d后，提取HepG2-NTCP、HepaRG和PHH細(xì)胞的總RNA，采用qRT-PCR檢測(cè)HBV3.5kbmRNA水平。我們發(fā)現(xiàn)：1）在三個(gè)細(xì)胞系中，下調(diào)E-cadherin組的HBV3.5kbmRNA水平較對(duì)照組分別降低約75%（P<0.001）、45%（P<0.01）和55%（P<0.001），見(jiàn)圖1.4。提示E-cadherin可促進(jìn)eHBV入胞。2）下調(diào)NTCP組的HBV3.5kbmRNA水平在三個(gè)細(xì)胞系中較對(duì)照組分別降低約72%（P<0.001）、65%（P<0.001）和80%（P<0.001），見(jiàn)圖1.4；同時(shí)，在HepG2-NTCP細(xì)胞中，其降低的幅度與下調(diào)E-cadherin組相似；而在HepaRG和PHH細(xì)胞中，下調(diào)NTCP組的HBV3.5kbmRNA水平較下調(diào)E-cadherin組降低更為明顯，見(jiàn)圖1.4。提示在不同細(xì)胞系中，E-cadherin和NTCP對(duì)eHBV的入胞的影響存在一定差異。3）同時(shí)下調(diào)E-cadherin和NTCP組的HBV3.5kbmRNA水平在三個(gè)細(xì)胞系中分別較相應(yīng)對(duì)照組降低約90%（P<0.001）、65%（P<0.001）和90%（P<0.001），見(jiàn)圖1.4；在HepG2-NTCP和PHH細(xì)胞中，同時(shí)敲低E-cadherin和NTCP組HBV3.5kbmRNA的水平低于其它兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，見(jiàn)圖1.4。提示在HepG2-NTCP和PHH細(xì)胞中，E-cadherin和NTCP對(duì)eHBV感染肝細(xì)胞的影響可能存在協(xié)同作用。


本文編號(hào)：3393814